竹黄菌高效利用玉米糁固态发酵产竹红菌素的研究

发布时间：2020-06-07 13:05

【摘要】：竹黄菌(Shiraia bambusicola)是中国常见的一种药用真菌,民间常用其来治疗风湿性关节炎、坐骨神经痛、腰肌劳损、跌打损伤和虚寒胃痛等疾病。作为竹黄菌的主要活性成分,竹红菌素是一种优良的光敏剂,其在特定的光照条件下能够产生活性氧(ROS)。ROS会损伤生物大分子并导致细胞的凋亡。竹红菌素在抗菌,抗病毒和抗肿瘤等方面展现出良好的药理活性,在食品,饲料,环保和医疗等领域有着巨大的潜在应用价值。但目前商业应用和科研使用均是基于天然得到的竹红菌素,无法解决量产的问题。天然竹黄具有地域局限性、生长季节短暂和产量低等缺陷,因此通过生物发酵法来获得竹红菌素成为主要趋势。而与液态发酵(LSF)相比,固态发酵(SSF)具有能量消耗低,生产成本低,无废水排放,体积生产率高且不易染杂菌,一些应用无需提取纯化便可直接使用等优势,所以SSF生产竹红菌素成为本研究的重点。本课题组前期已经筛选获得一株高产竹红菌素的竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168,并对竹黄菌的发酵基质和培养条件进行了研究。本论文对竹黄菌进行了以下研究:光照对竹黄菌生长、繁殖及色素产生的影响;竹黄菌SSF时的生长分析;对竹黄菌的SSF培养(种子液类型,搅拌和外源添加淀粉酶)进行了优化;竹黄菌SSF培养时淀粉酶的分离纯化;竹黄菌内淀粉酶的预测与分析;过表达淀粉酶对竹黄菌的影响;过表达血红蛋白对竹黄菌的影响。主要研究结果如下:(1)光照对竹黄菌的影响。暗培养时色素的产量最高,为每平板13.73 mg;蓝光下培养时色素的产量最低,为每平板2.83 mg。与暗培养相比,所有的光照培养都促进了气生菌丝的生长,但降低了色素的产量。气生菌丝在蓝光培养时的生成量最多。光照促进了竹黄菌的有性繁殖但抑制无性繁殖,尤其是蓝光培养时强烈抑制无性繁殖。暗培养时竹黄菌仅进行无性繁殖,并且无性孢子产生的最多。有性孢子呈短棒状,无性孢子呈球状。使用光学显微镜和SEM观察到竹黄菌的四种菌丝:表面菌丝,气生菌丝,生物膜层菌丝和基质菌丝。发现竹红菌素仅在生物膜层菌丝进行合成分泌,暗培养时生物膜层菌丝的厚度为300μm左右。(2)竹黄菌SSF产竹红菌素的优化。以真菌种子培养液接种时,竹黄菌SSF的周期为15 d;初始搅拌在发酵第3 d进行;此后的搅拌间隔时间为36 h;外源添加淀粉酶以细菌中温α-淀粉酶和糖化酶的复合添加为最佳,其中细菌中温α-淀粉酶在固态发酵初始阶段加入,添加量为2.85 U?gds~(-1),糖化酶在发酵第3 d加入,添加量为29.78 U?gds~(-1)。经过搅拌和外加淀粉酶的研究后,色素产量在发酵13 d后达到60.74 mg?gds~(-1),固态发酵物中淀粉的残留量为27.42%。(3)对竹黄菌SSF的淀粉酶进行了分离纯化,经过冷乙醇沉淀,阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步纯化后得到一电泳纯的α-葡萄糖苷酶AMY33,分子量为108.2 kDa,最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。以α-pNPG为底物时,AMY33的K_m,V_(max)和k_(cat)/K_m分别为0.52 mmol·L~(-1),3.76 U·mg~(-1)和1.3×10~4 L·s~(-1)·mol~(-1)。而当以淀粉和麦芽糖为底物时,α-葡萄糖苷酶的K_m分别为2.38 mg·mL~(-1)和0.62 mmol·L~(-1)。AMY33对麦芽糖和蔗糖具有转糖基活性,而对海藻糖没有转糖基活性。同时,AMY33能够水解蔗糖的α-1,2-糖苷键,并且对海藻糖的α-1,1-糖苷键也有微弱的活性。AMY33的基因序列中有长度为2997 bp的阅读框,编码998个氨基酸,其中有22个氨基酸组成的信号肽;序列中含有一个长度为48 bp的内含子。AMY33的等电点大约是5.08。对竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168的淀粉酶进行了预测和分析。总共存在24个淀粉酶,其中有10个是α-葡萄糖苷酶,3个葡糖淀粉酶,8个α-淀粉酶,3个支链淀粉酶。(4)以不同碳源(葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,直链淀粉,支链淀粉酶和玉米粉)对竹黄菌进行培养,对24种淀粉酶的表达水平进行分析。在以麦芽糖,直链淀粉和支链淀粉为碳源进行培养时,amy33,amy365-1和amy130的表达水平分别最高。对淀粉酶进行过表达研究,构建了五株过表达菌株。LSF培养时,与野生菌相比较,五株过表达菌株的生物量和色素的产量随发酵时间逐渐增加,而残糖量逐渐降低。SSF培养时,在amy365-1和amy130共表达的菌株,色素的产量在第13 d达到最高产量71.85 mg·gds~(-1),是野生菌色素产量(25.37 mg·gds~(-1))的2.83倍。当amyAF,amy365-1或者amy130进行过表达时,amy33的相对表达水平得到了增加。经过15 d的发酵后,amy365-1和amy130共表达菌株发酵基质中淀粉的残留量为19.56%。(5)对血红蛋白基因vgb进行了过表达研究,构建了两株过表达菌株。LSF培养时,当amy365-1和vgb共表达时,色素在96 h时到达了最高产量3681 mg?L~(-1),是野生菌色素产量(703 mg?L~(-1))的5.24倍;SSF培养时,在amy365-1和vgb共表达时,色素达到了本研究的最高产量75.89 mg·gds~(-1)。在vgb进行过表达时,amy365-1的相对表达水平得到了提升,同时提高了SSF时淀粉酶的活力;此外,SSF的周期由13 d缩短到11 d。经过15 d的发酵后,amy365-1和vgb共表达菌株发酵基质中淀粉的残留量为16.87%。
【图文】：

竹黄,子座,化学结构,D-半乳糖

图 1-1 竹黄子座中主要生物活性成分的化学结构Fig. 1-1 Chemical structures of biological active components in the stromata of S. bambusicola（2）竹黄菌多糖真菌多糖是药用真菌具有生物活性的主要有效组分，其在生物体内不仅提供能量与结构组成，更具有多种生物学功能。方积年等[7]将竹黄子实体经分离后按常规发酵分离，纯化得到竹黄多糖 SB1 和 SB2 两个组分，SB1 包含 D-葡萄糖、D-半乳糖和拉伯糖，摩尔比为 0.37：1.00：0.07；SB2 包含 D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和拉伯糖，，摩尔比为 0.25：1.00：0.47：0.12。蔡宇杰等从竹黄菌 Shiraia sp. SUPER-H1

衍生物,色素,光动力学疗法

12 位则取代基多样，由此构成多种化合物或化合物的不同类型。傒醌类色素母环及其几种主要衍生物见图1-2。傒醌类化合物是一类能够产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的光敏性物质，如同其在自然界中的许多重要功能，其在医学领域和农业领域展现出巨大的应用潜力。例如，卡弗他丁 C（calphostin C）是作用于蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）调节区的特异性抑制剂[18]，同时也被用于癌症治疗的研究[19-21]。竹红菌素及其衍生物在中国已经应用于临床，同时被广泛用于光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）来进行肿瘤治疗和抗病毒的研究[22-25]。其中，ROS 被广泛定义为含有氧原子的化学活性分子
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1

【参考文献】