恩拉霉素高产菌株的定向选育

发布时间：2020-06-11 15:23

【摘要】：恩拉霉素是一种多肽类抗生素,是杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)经过发酵获得的次级代谢产物,可抑制革兰氏阳性菌生长。恩拉霉素多用于饲料中,可有效提高饲料的利用率,有利于动物的增重。恩拉霉素作为饲料添加剂,不易被肠道吸收,可直接排出体外,不会造成动物体内抗生素残留问题;长期使用不易产生耐药性,也不会与其它临床应用的抗生素产生交叉耐药性。因此恩拉霉素是目前仅有的几种可用于饲料添加剂的抗生素之一,近年来,国内外需求有明显上升趋势。目前恩拉霉素的生产方式为微生物发酵法,但其生产过程中普遍存在恩拉霉素产量低、菌株生产稳定性差,生产菌种退化严重等问题,因此导致目前国内恩拉霉素生产成本一直居高不下。本研究针对恩拉霉素生产菌产素水平低、退化现象严重等问题,通过分子生物学等手段将一个硫链丝菌素抗性标记基因(tsr ORF)整合至恩拉霉素生物合成基因簇中,使硫链丝菌素抗性基因的表达与恩拉霉素生物合成基因簇中某些关键基因的表达相连锁,并通过硫链丝菌素高抗性筛选,获得恩拉霉素生物合成基因稳定表达(或高表达)菌株,即恩拉霉素高产菌株。根据对恩拉霉素生物合成基因簇的分析,其中endA、endB、endC、endD是恩拉霉素生物合成过程中负责编码非核糖体多肽合成酶的关键基因。将硫链丝菌素抗性基因分别对齐部分替换这4个非核糖体多肽聚合酶NRPS基因,通过硫链丝菌素抗性筛选获取菌株具备较大的产素潜力的菌株;最后通过基因回补实验,去除tsr标记基因,恢复原有基因结构,从而获得恩拉霉素高产菌株。但由于该方法需要基因回补实验较为繁琐,于是对此方法进行了进一步改进,将tsr基因插入到nrps基因后,不影响恩拉霉素基因簇的表达,使硫链丝菌素抗性基因(tsr)串联在nrps基因后使得与恩拉霉素生物合成基因表达相关联。该方法为恩拉霉素高产菌株的选育提供了一个筛选标记,通过抗性筛选标记筛选退化菌株中强壮菌株,解决了传代过程中造成的菌株不断退化问题,以及通过抗性筛选获得高产菌株,此方法大大提高了恩拉霉素高产菌株的筛选效率,该方法是用于恩拉霉素高产菌株定向选育的一个新方法。本实验还通过对恩拉霉素生物合成过程中的调控基因进行研究,通过基因敲除方法分析调控基因对恩拉霉素合成的影响,通过对正调控基因过表达的方法达到提高恩拉霉素的产量。构建的过表达菌株平均效价为4380 U/mL,出发菌株S.fun TCCC F110发酵液的效价为3868 U/mL,过表达菌株产恩拉霉素能力比S.fun TCCC F110株提高了 13.24%。
【图文】：

手段对恩拉霉素生产菌株进行改造提供了依据。恩拉霉素生物合成基因簇长８４邋ｋｂ左逡逑右，２５个开放阅读框，，其中ｗ；／３６、３７、３８、４０四个开放阅读框是四个ＮＲＰＳ基因，逡逑负责生物合成大环骨架［２８］。恩拉霉素生物合成基因簇如图１－３所示。该图源于Ｔｈｅ逡逑ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｕｓｔｅｒ邋ｆｒｏｍ邋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ邋ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ邋４１邋0逡逑0ｒｆ１邋２逦３逦４邋Ｓ逦６逦７逦８逦９逦１０逦１１逦１２逦１３逦１４逦１５邋１Ｓ邋１７逦１８邋１９逡逑Ｃ＝Ｃ＞Ｃ＝Ｃ＞Ｃｃ￡Ｃ＞＜＝３邋［＝＝士ＺＺ＝Ｃ＞＜＝＾ｔ＝＝Ｃ＞ｔ＝＝＞＜Ｃ＝＝＝３Ｃ＝３＜＾３＜Ｃ：＾＝＝＾ｔ＝＝＝＝＞ＣＺ＾Ｃ＝＞＜＾ＺＫ＞＜＝＝＝ｌ逡逑２０邋２１逦２２逦２３邋２４邋２５邋ｍｎｄＲ邋？ｎｄＱ邋？ｎ＜ｉＰ邋２９逦３０邋３１邋３２邋３３邋３４邋３５逦？ｎｄＡ逡逑ｃ＝＝＾ｃ＝＝＝Ｃ＞邋ｔ邋邋逦逦邋ｉ邋＜ｌ＿ｌｌ邋？■■？邋？－逦＞邋Ｉ邋？丨丨丨丨１丨邋＜邋ＩＩＩ邋＿邋ＩＩＩ邋ＩＩ．丨丨丨丨｜丨？！＝３￡ｓｓｓｍｓ＝：：ｓｓｓ＾＾逡逑ｅｎ＜ＳＢ逡逑？ｍ／Ｃ逡逑３９邋？ｎｄＯ逦４１逦４２逦４３逦４４逦４Ｓ逦４６邋４７邋４８逦？．．逡逑—二—＾４—＿１邋￣￣￣逦）逡逑图１－３恩拉霉素生物合成基因簇逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋ｔｈｅ邋ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｕｓｔｅｒ逡逑４逡逑

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【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ927

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本文编号：2708097