玉米赤霉烯酮降解酶发酵工艺优化及其降解产物分析

发布时间：2020-07-20 07:55

【摘要】：玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一种真菌毒素,是镰刀菌的次级代谢产物,在自然界中广泛存在,具有雌激素效应,早期从霉变的玉米中得到。这种真菌毒素对人和动物特别是猪表现出很强的生殖毒性,因此多种降解玉米赤霉烯酮的方法被人们所探索。本文对降解ZEN的菌株ZENL09进行鉴定,优化了ZENL09产玉米赤霉烯酮降解酶的发酵工艺条件,分析了酶法降解玉米赤霉烯酮的产物,探讨了降解产物的细胞毒性。具体内容如下:(1)研究发现,菌株ZENL09的发酵上清液对玉米赤霉烯酮有较好的降解效果,其降解率为53.59%。通过对该菌株形态的观察、理化特性分析,测定其16S rRNA序列,在NCBI上的BLAST对比,初步鉴定菌株ZENL09为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。(2)优化了该菌株产玉米赤霉烯酮降解酶的发酵工艺条件,其最优发酵条件为:发酵周期24h,接种量3%,摇床转速200r/min,装液量25mL/250mL,发酵温度为33℃,发酵培养基初始pH8.0;最优发酵培养基为:蔗糖20(g/L),蛋白胨26.67(g/L),酵母粉13.33(g/L)。在最优的发酵工艺条件下,ZENL09的发酵上清液对ZEN的降解率达到了88%。(3)ZENL09的发酵上清液用蛋白酶K及沸水浴处理后发现ZEN的降解率明显降低,证明ZENL09发酵上清液对ZEN的降解是酶的作用。将发酵上清液用3KD和10KD超滤管离心浓缩后,得到的截留部分都有降解率,且降解率无明显差异,说明能够降解ZEN的酶存在于被10KD超滤管离心浓缩后的截留部分且降解酶的分子量大于10,000Da。再将截留部分进行SDS-PAGE试验,发现电泳图中有两条明显的条带,推测ZEN降解酶的分子量大小为25.0KDa或66.2KDa。(4)系统研究了不同流动相对HPLC分析ZENL09的发酵上清液降解ZEN的产物的影响,最后确定最适流动相为:乙腈/水=35/65(v/v),在该流动相条件下,找到了保留时间为9.5min时的产物峰。采用高分辨液质联用仪对产物进行分析,确定降解产物的相对分子量为256,再将降解产物用串联质谱打碎分析,初步推测了降解产物可能的结构。(5)研究了降解产物对HepG2细胞的毒性,发现降解产物对HepG2细胞的毒性与ZEN相比降低了很多。
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925
【图文】：

结构式

ZEN 的存在，王金勇等[3]调查界大部分国家规定粮食谷物和食卫生标准规定饲料中 ZEN 允许 ZEN 的限量标准为 60μg/kg[6]。小米、芝麻、高粱、大米、燕麦真菌毒素[7-13]。结构及理化性质了 ZEN 的化学结构如图 1.1 所-雷锁酸内酯，分子式为 C18H22O 165℃，对热较稳定，120℃加热化碳，但可溶于碱性水溶液、乙等物质，微溶于石油醚。研究发蓝色荧光[15]。

照片,显微镜,菌株,照片

图 2.1 菌株 ZENL09 显微镜(1000X)观察照片Figure 2.1 The cell morphology of ZENL09图 2.2 菌株 ZENL09 的平板菌落形态Figure 2.2 The colony morphology of ZENL09NL09 形态特征为：菌落表面粗糙不透明，微可见形态为椭圆到柱状，着色均匀，无荚膜，.1）。理生化特性

形态图,菌株,形态,生理生化特性

ZENL09 形态特征为：菌落表面粗糙不透明，微黄色带点红（见图2.2）。在显微镜下可见形态为椭圆到柱状，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，为革兰氏阳性菌（见图 2.1）。2.3.2.2 菌株的生理生化特性由菌株ZENL09的生理生化特性分析可知，在酶活与碳源同化试验中，ZENL09可分解利用多种物质，也可在代谢过程中产生多种酶（见表 2.4），在表 2.5 中可看出 ZENL09 可利用多种碳源产酸，其产酸结果如下表所示。

【参考文献】