高F值酵母寡肽的制备及双酶共固定化

发布时间：2020-07-21 21:33

【摘要】：高F值寡肽是一类富含支链氨基酸的小肽混合物,它具有多种生理活性包含保肝护肝、治疗苯丙酮尿症、抗疲劳等,是目前活性肽领域的研究热点之一。本研究以活性干酵母为制备高F值寡肽初始原料,利用超声破碎酵母细胞壁并对破碎工艺进行优化,获得破碎优化条件:超声功率400 W、时间20 min。从四种常用内切酶中筛选出碱性蛋白酶作为最适酵母抽提酶来获取酵母蛋白,单因素优化碱性蛋白酶抽提酵母细胞的最适条件为料液比1:6、温度50℃、加酶量1000 U·g~(-1)、pH 8.0、酶解时间6 h。采用纳滤浓缩酵母抽提液并去除游离氨基酸获得酵母粗肽,优化获得操作条件:500Da纳滤膜、0.3 MPa、浓缩3倍。利用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A双酶依次定向酶解酵母粗肽使芳香族氨基酸从酵母粗肽内游离出来。对这两种酶进行单因素和正交优选实验,获得α-胰凝乳蛋白酶最佳酶解条件:加酶量8000 U·g~(-1)酵母粗肽、温度40℃、pH 8.0、时间5 h;羧肽酶A最佳酶解条件:加酶量4 U·mL~(-1)、温度40℃、酶解pH 8.0、时间4 h。采用活性炭吸附,将游离的芳香族氨基酸去除以获得高F值寡肽。通过单因素优化获得最佳吸附条件:吸附时间2 h,吸附温度30℃,吸附pH 2.5,吸附炭液比1:10。在此集成工艺下成功获得了数批F值在30-40之间的高F值酵母寡肽,整个过程多肽得率为14.1%,寡肽分子量1000 Da以下占比95%。为降低高F值寡肽生产成本,利用溶剂热法制备得到一种具有立体结构的复合磁性纳米粒子。通过扫描电镜、透射电镜、比表面分析仪、X射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪、Zeta电位仪等进行性质表征,结果表明制备获得的磁性纳米颗粒平均粒径为12 nm,具有Fe_3O_4尖晶石结构而比表面积为78.9377 m2·g~(-1)且富含不同官能团。利用制备的磁性纳米颗粒固定α-胰凝乳蛋白酶,发现制备的固定化酶可重复利用性好且具有比游离酶更好的pH稳定性和热稳定性。固定化α-胰凝乳蛋白酶循环使用8次(40℃、pH 8.0),酶活剩余率为65%。室温保存30天,固定化α-胰凝乳蛋白酶酶活剩余率为60%。以制备的磁性纳米颗粒为核心先固定α-胰凝乳蛋白酶再结合包埋法利用混合羧肽酶A的海藻酸钠包被磁性纳米颗粒形成双酶共固定的磁性凝胶颗粒,对于包埋条件进行了单因素优化,确定海藻酸钠浓度2.5%(w/v)、CaCl_2溶液浓度5%(w/v)、羧肽酶A加酶量500 U、固定时间2 h。通过荧光标记确认双酶均匀结合到了磁性凝胶颗粒上。利用制备的固定化酶酶解酵母粗肽,发现酶解5次后酶活剩余率为30%。通过对制备高F值寡肽的两种酶进行固定化并应用于实际酶解,发现双酶经固定化虽然酶解效率有所降低但是可实现重复使用,可见双酶共固定化具有一定的应用前景。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464.7

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