紫芝胞壁多糖的分离纯化、结构鉴定及其免疫活性研究

发布时间：2020-07-30 20:14

【摘要】：灵芝是一味珍贵的药食两用真菌,具有强身健体、延年益寿的功效,在中国有着悠久的历史记载。紫芝是灵芝家族中的重要成员,与赤芝一同收录于2000年版的《中国药典》中,成为法定灵芝药材之一。多糖作为紫芝中的主要活性成分,具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降糖保肝、解毒等多种功效。目前,紫芝多糖的研究集中于菌丝体多糖及子实体水溶胞内多糖,然而已有研究表明,食用菌的细胞壁中的多糖成分也有良好的免疫活性,提取紫芝水溶性胞内多糖后,也剩余有大量的残渣,因此有必要对紫芝水提后的残渣进行研究,寻找可以进一步开发的活性多糖。本论文以紫芝子实体水提后的残渣为研究对象,通过超微粉碎、提取、分离纯化获得紫芝细胞壁多糖,并对分离、纯化的多糖的理化性质、化学结构和免疫活性进行考察,为紫芝细胞壁多糖的深入开发利用提供科学数据。本论文的主要研究结果如下:通过对紫芝子实体水提残渣进行超微粉碎、热水浸提、分步醇沉(30%、50%、70%)获得紫芝细胞壁多糖粗提物(30%、50%、70%醇沉沉淀和70%醇沉上清组分)。对醇沉组分样品的得率、多糖含量、分子量分布和单糖组成进行分析。结果发现,多糖粗提物的总得率为2%,其得率显著高于紫芝子实体水溶性胞内多糖的得率。多糖粗提物主要集中在30%、70%醇沉沉淀和70%醇沉上清部分;按照分子量分布的大小,又可将粗提物分为大分子量组分(~10~6 g/mol)和小分子量组分(10~3~10~4g/mol)。各组分的多糖含量均高于75%,大分子量组分的多糖含量为98.99%,单糖组成主要以葡萄糖为主;小分子量组分(~10~4 g/mol)的多糖含量为97.17%,小分子量组分(~10~3 g/mol)的多糖含量为75.33%,小分子量组分中除了具有与子实体水溶性胞内多糖相同的五种单糖(岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖)外,还含有少量的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸组分。通过低浓度乙醇沉淀、离子交换柱层析和凝胶柱层析对醇沉粗提物进一步的分离纯化,共获得7个均一多糖。从30%醇沉组分中分离出1个大分子量(155.2?10~4g/mol)的均一葡聚糖GSCW30E-20E;通过离子柱层析从70%醇沉组分中洗脱分离出水相组分GSCW70E-W(2.2?10~4 g/mol)和盐相组分GSCW70E-S(2.5?10~4g/mol),其中盐相组分表现出一定的体外免疫活性。通过离子柱层析、凝胶柱层析从70%醇沉上清中分离出4个小分子量均一多糖,GSCW70EU-W2(5.6?10~4g/mol)、GSCW70EU-W4(0.8?10~4 g/mol)、GSCW70EU-S1(55.1?10~4 g/mol)、GSCW70EU-S2(3.2?10~4 g/mol)。其中GSCW70EU-W4为主要组分,具有显著的体外免疫活性。通过红外光谱分析、甲基化分析以及核磁共振分析对部分均一多糖的结构进行表征,对大分子量多糖GSCW30E-20E的结构进行解析:大分子量葡聚糖GSCW30E-20E既具有α构型也有β构型。每9个β-(1,3)-葡萄糖残基和1个α-(1,4)-葡萄糖残基相连为主链,每3个β-(1,3)-葡萄糖残基主链上通过β-(1,6)-糖苷键连有一个葡萄糖残基为支链。小分子量组分GSCW70E-W和GSCW70EU-W4既具有α构型也有β构型,GSCW70E-S只具有β构型。此3个小分子量组分多糖结构的主链以β(1,3)、β(1,4)和β(1,6)连接为主,支链在β(1,3,4)和β(1,3,6)上。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ281
【图文】：

分析图,1H核磁共振谱

化的糖醇乙酰酯链接方式保留时间摩尔比,4,6-Me4-Glcp Glcp(1→12.60 7.49,6-Me3-Glcp →3)-Glcp-(1→13.79 12.76,6-Me3-Glcp →4)-Glcp-(1→13.94 6.48,4-Me3-Glcp →6)-Glcp-(1→14.26 2.50,6-Me2-Glcp →3,4)-Glcp-(1→15.63 1.00,4-Me2-Glcp →3,6)-Glcp-(1→15.74 5.54均一多糖的核磁共振分析 GSCW30E-20E 的 NMR 分析图 4-9 所示，在1H NMR 谱中, 异头区 4.2-5.8 的范围内，有四个信号分07、 4.52、 4.49、 4.21，其中 5.07 的异头氢信号，说明含有构型葡萄 4.52、 4.49 和 4.21 说明含有 β 构型葡萄糖残基。

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通过 HSQC 谱确定对应的碳的化学位移。残基 B 和 D MeG 的标准化学位移相比往低场强移动，说明发生了取代，因3)- -D-Glcp-(1→。氢的化学位移是 4.52，说明该糖残基是 β 构型。通过从 COSY过交叉峰找到 H-2 的位置，其化学位移是 3.28。H-3 和 H-4 通过Y 谱进行归属，化学位移分别为 3.48 和 3.24。通过 HSQC 谱中 68.86，确定 H-6 的化学位移为 4.02 和 3.54。H-5 通过 H-6交叉峰和 TOCSY 谱中的信号确定为 3.47。残基 C 中的所有 H，通过 HSQC 谱确定对应的碳的化学位移。残基 C 的 C-3（8）MeG 的标准化学位移相比往低场强移动，说明发生了取代，→3,6)- -D-Glcp-(1→。头氢的化学位移是 4.21，说明该糖残基是 β 构型。H2-H6 的化学的 COSY、TOCSY 以及 HSQC 中得到归属。同时根据氢的化学找到碳的化学位移。将残基 E 的化学位移值与文献[16]对比十分-D-Glcp-（1→。

核磁共振,核磁共振

GSCW30E-20E的核磁共振TOCSY谱

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