酰基辅酶A结合蛋白在红曲霉红曲色素合成代谢中的研究

发布时间：2020-08-12 04:39

【摘要】：红曲古代称丹曲,在我国有1000多年历史,它是以大米为原料,接种红曲霉发酵而成的红曲色素,属于天然可食用色素。红曲色素的化学结构由聚酮发色团和脂肪酸链两部分组成。酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)作为高度保守蛋白,存在于真核生物和原核生物中,主要参与脂肪酸代谢。本论文主要对红曲霉CICC41233中2个ACBP(MrACBP)编码基因开展与红曲色素合成相关研究,取得的主要结果:(1)Mracbp基因克隆:以红曲霉CICC41233总DNA和cDNA为模板,PCR扩增得到Mracbp基因。经测序后分析Mracbp1 DNA序列全长629 bp,RNA序列全长450 bp,有2个内含子,编码149个氨基酸,预测分子量16 kDa,NCBI核酸Blast比对与Aspergillus vadensis CBS 113365 ACBP-domain-containing protein(BO88DRAFT_483611)(XM_025712234.1)同源性73.97%,蛋白质Blast比对与Aspergillus sclerotiicarbonarius CBS 121057(PYI08169.1)ACBP同源性37.21%。Mracbp2 DNA序列全长1525 bp,RNA序列全长1329 bp,有3个内含子,编码442个氨基酸,预测分子量51 kDa,NCBI核酸Blast比对与Aspergillus nomius NRRL 13137 acyl CoA binding protein(ANOM_009680)(XM_015554936.1)同源性72.59%,蛋白质Blast比对与Aspergillus nomius NRRL 13137(XP_015401904.1)ACBP同源性72.11%。(2)重组蛋白与底物脂酰辅酶A结合能力测定:将不含内含子的Mracbp1构建于原核表达载体pMAL-c4X,转化大肠杆菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG诱导目的蛋白大量表达,纯化后获得MBP-MrACBP1融合蛋白,微量热泳动结合实验表明与C_(14:0)脂酰辅酶A结合能力最强。将不含内含子的Mracbp2构建于原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌E.coli BL21菌株,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后获得GST-MrACBP2融合蛋白,微量热泳动结合实验表明与C_(16:0)脂酰辅酶A结合能力最强。(3)Mracbp在红曲霉CICC41233中过表达产红曲色素分析:构建Mracbp1基因表达载体pNeo0380-gpdA-acbp1和Mracbp2基因表达载体pNeo0380-gpdA-acbp2,农杆菌Ti质粒介导转化红曲霉CICC41233,分别获得工程菌株红曲霉ACBP5和红曲霉ACBP-E。相比红曲霉CICC41233,红曲霉ACBP5发酵6 d,红曲色素产量提高12.70%。发酵2 d,荧光定量PCR结果显示acbp1和红曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA、fasB基因表达分别上调77.39倍、6.41倍、3.21倍、3.42倍、4.41倍。红曲霉ACBP-E发酵6 d,红曲色素产量提高37.73%。发酵2 d,荧光定量PCR结果显示acbp2和红曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA和fasB基因表达分别上调1.74倍、2.7倍、2.51倍、2.20倍、3.11倍。(4)红曲霉CICC41233中acbp2基因敲除:为提高红曲霉基因敲除效率,构建DNA ligase IV(ligD)基因敲除载体,农杆菌Ti质粒介导转化红曲霉CICC41233,获得突变体菌株红曲霉△ligD。在此基础上,农杆菌Ti质粒介导将构建的Mracbp2基因敲除载体转化红曲霉△ligD,挑选50个转化子进行筛选验证但并未得到成功敲除acbp2基因的红曲霉突变体菌株。(5)Mr ACP蛋白表达与纯化:在酰基载体蛋白(ACP)编码基因终止密码子前引入His标签蛋白,连接于原核表达载体pMAL-c4X中,构建MBP+His双标签蛋白表达系统,转化大肠杆菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG诱导目的蛋白大量表达,镍柱纯化后获得MBP-MrACP-His融合蛋白。本论文探究了ACBP对红曲色素合成的影响,为提高红曲色素的产量提供新思路,为构建高产红曲色素的工程菌株提供新方向。
【学位授予单位】：江西科技师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925.7;Q78
【图文】：

霉CICC41233 总RNArophoresis of total of R板， PCR反应扩增曲霉 Dacbp 基因凝horesis of Mracbp gen

图 2.2 红曲霉 Dacbp 基因凝胶电泳图2.2Agarose gel electrophoresis of Mracbp gene（a. Dacbp1 b. Dac的cDNA作为模板，进行PCR反应扩增基因片段，琼脂糖 所示。

17图 2.3 红曲霉Racbp基因凝胶电泳图Agarose gel electrophoresis of Mracbp gene（a. Racbp1 b.

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本文编号：2790061