山药多糖的硫酸酯化及其对医用聚乳酸表面修饰的研究

发布时间：2020-08-21 03:38

【摘要】：医用聚乳酸广泛用于生物医用材料领域,但其表面生物相容性差,主要体现在如诱导血栓的形成,无细胞识别的有效位点,亲水性差不利于细胞增殖黏附等。故而要对其表面进行改性修饰来提高生物相容性。而把在机体内具有较好生物相容性的生物活性大分子多糖、蛋白质等固定在医用材料表面是提高其生物相容性的有效手段。本论文首先采用超声辅助热水浸提法从山药中提取多糖,并对其进行硫酸化改性制备山药多糖硫酸酯,随后采用层层自组装的方法在医用聚乳酸表面构建山药多糖硫酸酯/壳聚糖(SCYP/CS)多层膜并对其表面进行改性修饰,制备出了一种兼备生物相容性和生物功能性的医用聚乳酸材料表面。主要研究如下:采用超声辅助热水浸提法提取铁棍山药干片中的山药多糖。采用单因素实验、Box-Behnken中心组合设计及响应面分析法对山药多糖的提取条件进行优化,确定山药多糖的最佳提取工艺参数:提取温度40℃,料液比1:8,提取时间40min,超声功率270W。通过响应面分析得到最优提取率是16.32%,验证试验的提取率是16.42%,验证了模型的可行性。然后分离纯化后的中性山药多糖(CYP)。对CYP进行I_2-KI测试,表明CYP不含有淀粉。采用浓硫酸法对CYP进行硫酸化改性,制备了不同反应时间下的山药多糖硫酸酯(SCYPs)。其中,SCYP1取代度为0.27;SCYP2取代度为0.87;SCYP3取代度为1.4。对CYP和SCYPs的特征吸收峰、单糖组成、分子量、螺旋结构进行分析。从紫外光谱中得出260~280nm处有较弱的吸收峰,表明可能存在糖蛋白;从红外光谱中得到SCYPs既具有-OH和C-H这两种典型的多糖吸收峰,又具有S=O和C-O-S这两种硫酸基的特征吸收峰,表明了硫酸化改性成功;单糖组成分析得出CYP包含甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖,而在SCYPs中,岩藻糖均已降解;测定CYP和SCYPs的分子量分别为68.322kDa、17.182kDa、14.255kDa和9.495kDa,与CYP相比,硫酸化修饰后各衍生物的分子量均有明显下降;刚果红实验表明CYP在水溶液中具有三螺旋结构,在强碱溶液中三螺旋结构会解体,而SCYPs具有稳定的三螺旋结构。对CYP和SCYPs的抗氧化活性、抑菌活性、抗凝血活性、抗肿瘤活性进行评价。抗氧化实验表明多糖的硫酸化改性可能会提高天然山药多糖的自由基清除率;抑菌实验表明CYP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无生长抑制作用,而SCYPs对大肠杆菌没有生长抑制作用,对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用较强;抗凝血活性表明CYP没有抗凝血活性,而SCYPs的APTT和TT随浓度和DS的增加而明显延长;抗肿瘤活性表明SCYP3的抗Caco-2细胞增殖活性最突出。选取生物活性较好的SCYP3进行下一阶段实验。采用层层自组装技术,在医用聚乳酸膜表面交替沉积山药多糖硫酸酯(SCYP)和壳聚糖(CS),得到SCYP/CS多层膜。采用X-射线光电子能谱(XPS)、扫描电子显微镜(SEM)、水接触角测定仪及紫外可见分光光度计(UV-Vis)对多层膜的表面化学组成、形貌、亲/疏水性及膜的增长方式进行表征。XPS结果表明SCYP/CS多层膜上出现硫酸基和壳聚糖的特征元素(即S和N),随着层数的增加特征元素含量增加;SEM结果表明SCYP、CS交替组装后可将氨基化处理后的裂痕填平,但膜表面光滑程度不如聚乳酸膜;水接触角测试表明随着组装层数增加,水接触角呈现锯齿状交替降低,膜表面亲水性提高;多层膜的增长模式呈现出均匀连续性。对SCYP/CS多层膜的血液相容性、细胞增殖黏附性、抑菌效果进行评价。血液相容性测试结果表明经SCYP/CS多层膜改性后的医用聚乳酸可增加牛血清白蛋白的吸附量、降低血小板黏附率和激活效应、有效延长APTT和TT、抑制凝血系统(TAT、C3a、C5a)的激活且溶血率均小于5%;SCYP/CS多层膜改性聚乳酸对L929细胞的增殖黏附性较对照组有明显提高;改性后聚乳酸多层膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显示出了良好的抑制效果。以单宁酸(TA)作为模型药物,对(SCYP/CS)_5多层膜进行载药释药性测试。采用UV-Vis对多层膜载药性层层追踪,获得多层膜的最大载药量为29.88±0.005μg/cm~2。研究不同条件下载药多层膜的释药行为,发现随pH值、温度和离子强度的增加,TA的释放率逐渐增大。通过零级动力学、一级动力学、Higuchi方程及Riger-Peppars模型对释药曲线进行了拟合,建立了合适的释药模型。考察了载药多层膜对ABTS自由基的清除效果,发现多层膜所释放的TA能与ABTS自由基反应使得ABTS自由基溶液脱色,表明TA在多层膜可保持其固有的抗氧化活性。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1;TQ323.41
【图文】：

SEM图,聚乳酸,氨基,表面

昆明理工大学硕士学位论文54表面，氨基化后的裂痕被填平，呈现出物质沉积后的相对光滑，也说明CS和SCYP组装到了聚乳酸膜上。图4-2改性前后聚乳酸材料表面SEM图，（a）PLA膜，（b）氨基化处理后的PLA膜，（c）(SCYP/CS)5膜Figure4-2SEMimagesofPLAsurfacebeforeandaftermodification,(a)PLAmembrance,(b)PLAmembraneafteraminationtreatment,(c)(SCYP/CS)5membrance4.3.3多层膜的表面亲疏水性SCYP和CS交替沉积于PLA表面，表面的润湿性也能证实LBL组装的发生，而且接触角已广泛应用于自组装表面化学性质的检测[77]。在本实验中，我们构建了(SCYP/CS)6多层膜，组装在奇数层的是SCYP，组装在偶数层的是CS。图4-3显示了氨基化PLA膜上SCYP与CS相继暴露在最

SEM图,多层膜,细胞,表面

昆明理工大学硕士学位论文644.3.4.2SEM图4-12L929细胞在多层膜表面的SEM图Figure4-12SEMimagesofL-929cellsculturedfor24honthesurfaces通过SEM图片直接观察到L929细胞在多层膜表面的增殖黏附情况。如图4-11所示，（a）为L929在PLA表面，（b）、为L929在M-5多层膜表面。在多层膜上的L929细胞黏附数量明显多于PLA。这个结果与MTT实验得到的结果相同。而且L929细胞在膜表面充分铺展，触角展开，多数呈现出分化好的梭形，说明对PLA表面的层层自组装修饰能促进成纤维细胞L929的粘附和增殖。原因可能是修饰后的PLA表面亲水性提高，而且最外层的CS带正电荷，从而易于与细胞膜上的整合素受体结合来促进细胞的吸附[79]。4.3.7抑菌活性如图4-12所示，显示了SCYP/CS多层膜对E.coli和S.aureus的生长抑制率。已验证实验用的医用聚乳酸材料没有抑菌活性；SCYP对S.aureus有抑制作用，对E.coli没有抑菌活性；而CS是一类具有广谱抑菌活性的天然多糖。将SCYP和CS修饰于PLA表面，其抑菌活性依然没有改变。对于E.coli，当SCYP在最外层时，几乎没有抑菌效果，而当CS在最外层时，E.coli生长抑制效果明显。对于S.aureus，当SCYP在最外层时，随着组装层数增加，抑菌效果也逐渐增加，而当CS在最外层时，抑菌效果依旧十分显著。

效果图,多层膜,效果图,溶液

昆明理工大学硕士学位论文76NaCl=0mMT=45℃pH=7.4零级释药模型Mt/M∞=0.269t0.4833一级释药模型Mt=12.48706(1-e-0.01822t)0.97153Higuchi方程模型Mt/M∞=3.194t0.50.9033Riger-Peppars模型Mt/M∞=3.579t0.4760.89285.3.5ABTS自由基清除能力图5-7多层膜对ABTS溶液的脱色与否效果图Figure5-7DecolorizationofABTSformultilayermembrane包括TA在内的多酚的主要生物活性是其抗氧化活性。氧化自由基过量，就会造成DNA、蛋白质和其他重要的生物分子的氧化损伤。多酚类化合物能有效地清除这些物质，为机体提供保护。在此之前，ABTS+被用来测定各种材料的抗氧化活性。ABTS+稳定，呈蓝绿色。抗氧化剂与自由基阳离子反应会导致自由基溶液脱色，可测定其抗氧化活性。这里我们也用这种方法展示了LBL膜释放TA的抗氧化活性。如图5-7所示，对照组是（左瓶）：用NaCl=0mM、pH=8.5的PBS缓冲液稀释ABTS+母液，实验温度为室温；实验组是（右瓶）:用NaCl=0mM、pH=8.5的PBS缓冲液稀释ABTS+母液，实验温度为室温，ABTS稀释液中放入一片载药膜。可以看出随着时间的推移，对照组（左瓶）中ABTS+溶液颜色基本保持不变；实验组（右瓶）中的ABTS+溶液颜色逐渐变浅。6h后，蓝绿色完全褪去。由此可知，从多层膜中释放的TA仍能与ABTS+发生褪色反应，表明其仍具有抗氧化的活性。5.4本章小结1．通过对TA载药的紫外追踪，直观得到并计算获得具体单位面积的多层膜载药量。

【参考文献】