阿魏蘑漆酶同工酶酶学性质研究
发布时间：2022-01-02 07:17
漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶,具有作用底物广泛、产物无污染等优点,在食品制造、纺织印染、生物传感器等领域均具有极佳的应用潜力。漆酶同工酶LACC2和LACC6是阿魏蘑漆酶的主要组成成分,在阿魏蘑（Pleurotus eryngii var.ferulae）与胶红酵母（Rhodotorulla mucilaginosa）共培养提高漆酶表达水平的过程中,LACC2和LACC6的基因转录水平分别发生明显的上和下调。本论文围绕LACC2和LACC6进一步展开酶学性质等方面的探究,为共培养促进漆酶生产的机理研究提供理论依据。主要研究结果如下:（1）将基因lacc2和lacc6分别与表达载体pPIC9K相连,转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受态细胞中,获得重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc2和P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc6。通过对漆酶基因信号肽序列的切除以及诱导条件的优化,得到具有高漆酶表达量的两株重组菌株,酶活分别达到351.75 U·L-1和857...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
提高漆酶表达水平的措施Figure1-1Strategiesforincreasingtheexpressionleveloflaccases
第二章材料与方法112.2.3大肠杆菌重组质粒的构建将基因片段sspoxa3a和sspoxa3b与表达载体pET28a分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，16℃连接8~12h，构建重组质粒pET28a-sspoxa3a和pET28a-sspoxa3b并将其转化至E.coliBL21感受态细胞。经菌落PCR验证，选择片段大小正确的转化子进行培养，提取质粒送至公司进行测序。整个构建流程如图2-2所示。图2-1毕赤酵母重组质粒的构建流程图Figure2-1TheprocessofconstructingP.pastorisrecombinantvector
江南大学硕士学位论文122.2.4重组质粒的异源表达2.2.4.1重组质粒在毕赤酵母中的异源表达以下方法以重组质粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6的表达过程为例，重组质粒pPIC9K-sspoxa3a和pPIC9K-sspoxa3b的异源表达方式与之相同。（1）电转化毕赤酵母利用StuI线性化空质粒pPIC9K、重组质粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6，并纯化回收。提前参照文献[75]的方法制备毕赤酵母GS115感受态，将线性化后的质粒分别电转化到感受态细胞内，后培养2.5h再将菌液涂布于MD平板，30℃培养箱静置培养36h。（2）高拷贝数重组菌的筛选从MD平板中随机挑选出单菌落至带有G418抗性的YPD平板上，并逐步提高G418浓度（0.25、1、2、4mg·mL-1）以筛选高拷贝数的转化子。挑选在4mg·mL-1G418浓度的YPD平板上生长的酵母转化子P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6，提取其基因组进行菌落PCR。（3）ABTS变性板的筛选将对照菌株P.pastorisGS115/pPIC9K，重组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6分别接种至提前添加了ABTS的BMMY平板上，在平皿盖上滴加200μL甲醇，30℃培养箱中倒置且避光培养48h，观察是否会有墨绿色的变色圈出现。（4）重组菌的诱导表达将筛得的重组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2、P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6和转入了空质粒的对照组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K接种至YPD液体培养基中，在30℃、250r·min-1的条件下培养24h。以3.0%的接种量转接到BMGY培养基中，相同条件培养18h，以6000r·min-1的速度离心5min，收集菌体转至BMMY培养基中，继图2-2大肠杆菌重组质粒的构建流程图Figure2-2TheprocessofconstructingE.colirecombinantvector
【参考文献】：
期刊论文
[1]真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展[J]. 吴怡,马鸿飞,曹永佳,司静,崔宝凯. 生物技术通报. 2019(09)
[2]不同离子对漆酶酶活的影响[J]. 付林俊,刘海,张晓晴,张淑琴,任大军. 化学试剂. 2019(08)
[3]Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶学性质及其对酸性红1的脱色性能[J]. 窦欣,田乔鹏,王琦,管政兵,蔡宇杰,廖祥儒. 环境工程学报. 2019(04)
[4]肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达[J]. 王建玲,桂爽,付禹,张妤彤,郑东,路福平,刘逸寒. 天津科技大学学报. 2019(01)
[5]菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质[J]. 马俊,安启坤,唐文竹. 食品与发酵工业. 2019(04)
[6]整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达[J]. 陈珊珊,丁健,李鑫,刘军,贾禄强,槐强强,孙佼文,史仲平. 江苏农业学报. 2018(01)
[7]短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究[J]. 李成名,王佳懿,卢磊. 生物技术通报. 2018(03)
[8]白桦漆酶BpLAC1基因生物信息学分析[J]. 冯连荣,宋立志,赵大根,王玉成,池玉杰. 南方林业科学. 2017(03)
[9]黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质[J]. 赵秀艳,常飞,方泽民,张寅良,肖亚中. 生物工程学报. 2017(04)
[10]阿魏菇与胶红酵母共培养产漆酶对活性艳蓝W-RV的脱色[J]. 王寒,彭林,丁重阳,顾正华,张梁,石贵阳. 生物加工过程. 2015(05)
硕士论文
[1]竹林毛栓菌的诱变选育及其产酶条件优化[D]. 缪晓磊.浙江农林大学 2019
[2]共培养胶红酵母对阿魏蘑漆酶基因表达及其相关蛋白的影响[D]. 赵丽婷.江南大学 2017
[3]小菜蛾漆酶Ⅱ分子鉴定及其酶学特性[D]. 刘振刚.山东农业大学 2017
[4]平菇漆酶基因生物信息学分析和杂优-2平菇漆酶分离纯化及酶学性质、功能基团研究[D]. 廖海君.西南大学 2017
[5]信号肽、Kozak序列、N-糖基化对黑曲霉表达木聚糖酶的影响[D]. 王欣.东北农业大学 2016
[6]Pleurotus ferulae发酵产漆酶的研究[D]. 陈友枝.江南大学 2013
本文编号：3563735
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
提高漆酶表达水平的措施Figure1-1Strategiesforincreasingtheexpressionleveloflaccases
第二章材料与方法112.2.3大肠杆菌重组质粒的构建将基因片段sspoxa3a和sspoxa3b与表达载体pET28a分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，16℃连接8~12h，构建重组质粒pET28a-sspoxa3a和pET28a-sspoxa3b并将其转化至E.coliBL21感受态细胞。经菌落PCR验证，选择片段大小正确的转化子进行培养，提取质粒送至公司进行测序。整个构建流程如图2-2所示。图2-1毕赤酵母重组质粒的构建流程图Figure2-1TheprocessofconstructingP.pastorisrecombinantvector
江南大学硕士学位论文122.2.4重组质粒的异源表达2.2.4.1重组质粒在毕赤酵母中的异源表达以下方法以重组质粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6的表达过程为例，重组质粒pPIC9K-sspoxa3a和pPIC9K-sspoxa3b的异源表达方式与之相同。（1）电转化毕赤酵母利用StuI线性化空质粒pPIC9K、重组质粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6，并纯化回收。提前参照文献[75]的方法制备毕赤酵母GS115感受态，将线性化后的质粒分别电转化到感受态细胞内，后培养2.5h再将菌液涂布于MD平板，30℃培养箱静置培养36h。（2）高拷贝数重组菌的筛选从MD平板中随机挑选出单菌落至带有G418抗性的YPD平板上，并逐步提高G418浓度（0.25、1、2、4mg·mL-1）以筛选高拷贝数的转化子。挑选在4mg·mL-1G418浓度的YPD平板上生长的酵母转化子P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6，提取其基因组进行菌落PCR。（3）ABTS变性板的筛选将对照菌株P.pastorisGS115/pPIC9K，重组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6分别接种至提前添加了ABTS的BMMY平板上，在平皿盖上滴加200μL甲醇，30℃培养箱中倒置且避光培养48h，观察是否会有墨绿色的变色圈出现。（4）重组菌的诱导表达将筛得的重组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2、P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6和转入了空质粒的对照组菌株P.pastorisGS115/pPIC9K接种至YPD液体培养基中，在30℃、250r·min-1的条件下培养24h。以3.0%的接种量转接到BMGY培养基中，相同条件培养18h，以6000r·min-1的速度离心5min，收集菌体转至BMMY培养基中，继图2-2大肠杆菌重组质粒的构建流程图Figure2-2TheprocessofconstructingE.colirecombinantvector
【参考文献】：
期刊论文
[1]真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展[J]. 吴怡,马鸿飞,曹永佳,司静,崔宝凯. 生物技术通报. 2019(09)
[2]不同离子对漆酶酶活的影响[J]. 付林俊,刘海,张晓晴,张淑琴,任大军. 化学试剂. 2019(08)
[3]Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶学性质及其对酸性红1的脱色性能[J]. 窦欣,田乔鹏,王琦,管政兵,蔡宇杰,廖祥儒. 环境工程学报. 2019(04)
[4]肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达[J]. 王建玲,桂爽,付禹,张妤彤,郑东,路福平,刘逸寒. 天津科技大学学报. 2019(01)
[5]菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质[J]. 马俊,安启坤,唐文竹. 食品与发酵工业. 2019(04)
[6]整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达[J]. 陈珊珊,丁健,李鑫,刘军,贾禄强,槐强强,孙佼文,史仲平. 江苏农业学报. 2018(01)
[7]短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究[J]. 李成名,王佳懿,卢磊. 生物技术通报. 2018(03)
[8]白桦漆酶BpLAC1基因生物信息学分析[J]. 冯连荣,宋立志,赵大根,王玉成,池玉杰. 南方林业科学. 2017(03)
[9]黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质[J]. 赵秀艳,常飞,方泽民,张寅良,肖亚中. 生物工程学报. 2017(04)
[10]阿魏菇与胶红酵母共培养产漆酶对活性艳蓝W-RV的脱色[J]. 王寒,彭林,丁重阳,顾正华,张梁,石贵阳. 生物加工过程. 2015(05)
硕士论文
[1]竹林毛栓菌的诱变选育及其产酶条件优化[D]. 缪晓磊.浙江农林大学 2019
[2]共培养胶红酵母对阿魏蘑漆酶基因表达及其相关蛋白的影响[D]. 赵丽婷.江南大学 2017
[3]小菜蛾漆酶Ⅱ分子鉴定及其酶学特性[D]. 刘振刚.山东农业大学 2017
[4]平菇漆酶基因生物信息学分析和杂优-2平菇漆酶分离纯化及酶学性质、功能基团研究[D]. 廖海君.西南大学 2017
[5]信号肽、Kozak序列、N-糖基化对黑曲霉表达木聚糖酶的影响[D]. 王欣.东北农业大学 2016
[6]Pleurotus ferulae发酵产漆酶的研究[D]. 陈友枝.江南大学 2013
本文编号：3563735
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