天然产物葎草酮的全生物合成
发布时间：2022-01-20 05:25
葎草酮是啤酒花中的一种天然苦味酸,具有抗菌、消炎、镇痛、抗肿瘤等药理活性,一般由提取法制备。随着合成生物学和生物工程技术的不断进步,应用工程菌通过发酵法制备天然活性化合物成为一种研究趋势,本研究在工程菌中构建了葎草酮的全生物合成代谢途径并研究了发酵、提取与分析方法。本研究首先从实验室保存的大肠杆菌菌株Trc-low出发,将源于啤酒花的完整的葎草酮合成途径整合到到出发菌株中,构建了具备葎草酮全合成代谢途径的工程菌并进行了发酵验证。而后本研究利用高效液相色谱和核磁方法对发酵产物进行了定性分析,结果确证构建的工程菌可以在胞内合成葎草酮。本研究在产葎草酮菌株构建过程中表达的六个异源酶分别是异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）,异戊二烯基转移酶-1（PT1）,以及羧基辅酶A连接酶（CCL2）,戊-苯酮合酶（VPS）,异戊二烯基转移酶-2（PT2）和葎草酮合酶（monooxygenase）。这六个酶的对应基因经过密码子优化后重组到两个表达载体中用于工程菌的转化。在完成菌株的构建,发酵和产物验证后,本研究进一步对工程菌株的发酵条件进行了优化,研究了甲羟戊酸添加方式,接种量,诱导剂添加水平对工程菌株发酵产葎...
【文章来源】：青岛科技大学山东省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
啤酒花中葎草酮合成完整过程
天然产物葎草酮的全生物合成16草酮的合成可以更好的研究其独特的药用作用，并单独用作药物，以避免其它物质的干扰，且为其它苦味酸提供生物合成的依据，六种苦味酸化合物具有类似的合成途径和催化酶，同时葎草酮的合成也可为其它天然产物的合成提供示例，以为生物合成天然产物数量群的壮大贡献一份力量。或许葎草酮的生物合成还能用作它途，如与其它化合物的生物合成途径结合，以生产合成出具有靶标针对性的，药物作用更为强大和治疗更为精确的药物。1.3.2本课题研究方案本课题以实验室保存的含部分甲羟戊酸（MVA）下游途径的大肠杆菌Trc-low为出发菌株，设计并合成所需基因，再利用基因重组技术，将葎草酮的天然代谢途径引入Trc-low菌株中，构建出生产葎草酮的工程菌株，通过发酵技术表达合成出葎草酮产物，完整的课题研究技术路线如图1-2所示。（1）以实验室保存的含部分甲羟戊酸（MVA）下游途径的大肠杆菌Trc-low为出发菌株；（2）设计葎草酮合成代谢途径和方案，并确定合适的酶基因，在已知酶基因的基础上加上其它所需表达元件；（3）合成葎草酮代谢途径所需酶基因，并构建到合适的质粒载体上；（4）将表达载体导入大肠杆菌Trc-low中，通过摇瓶发酵进行表达生产葎草酮；（5）分离出发酵产物，并对其进行分子量和结构的鉴定，以验证代谢途径的可行性和正确性；（6）改变菌株发酵条件，以达到优化菌株生产葎草酮的目的；（7）放大菌株的发酵水平，以期达到增量生产葎草酮。图1-3研究技术路线Fig.1-3Technologyroutefortheresearch
青岛科技大学研究生学位论文232.3.1.2pACYDuet-1-CCL2-VPS-PT2表达载体设计依据实验室现存质粒，以及各种质粒载体的表达特性，实验选择了pACYDuet-1质粒载体，它是大肠杆菌宿主内的一种常见的蛋白双基因表达载体，还具有构建实验所需的两个多克隆位点，本身含有的启动子为T7启动子，在宿主细胞中高表达是它的优良特性，而氯霉素抗性是它本身自带的。研究过程中之所以选择pACYDuet-1质粒搭载CCL2-VPS-PT2基因片段，是因为它的高表达性，可以更好的表达质粒上连接的三个重要酶：戊-苯酮合酶（VPS）、羧基辅酶A连接酶（CCL2）、异戊二烯基转移酶-2（PT2），以利于产物的生成。选择好合适的质粒后，需要根据质粒碱基序列和目的基因碱基序列的特性来进行合理的设计，pACYDuet-1质粒载体已知包含有两个多克隆位点，即有了两处可以连接目的基因片段的位置，且质粒上已经具备了基本的目的基因表达元件T7启动子和RBS位点等，将羧基辅酶A连接酶（CCL2）以及异戊二烯基转移酶-2（PT2）分别克隆到两个多克隆位点，再克隆已经设计好的戊-苯酮合酶（VPS）到已经连接了羧基辅酶A连接酶（CCL2）的多克隆位点，最后，得到了一个完整的包含了我们所需要的三个目的基因的表达载体，构建的表达载体的具体片段特征已经表示下图中。图2-1pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2表达载体Fig.2-1TheexpressionvectorofpACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT22.3.2pTrcHis2B-IDI-PT1-Monooxygenase载体的构建2.3.2.1基因和载体的设计（1）IDI基因的设计根据啤酒花中葎草酮的代谢途径，目标产物葎草酮的合成过程中需要添加二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）到间苯三酚衍生物间苯异戊二酮（PIVP）上。因此，
本文编号：3598251
【文章来源】：青岛科技大学山东省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
啤酒花中葎草酮合成完整过程
天然产物葎草酮的全生物合成16草酮的合成可以更好的研究其独特的药用作用，并单独用作药物，以避免其它物质的干扰，且为其它苦味酸提供生物合成的依据，六种苦味酸化合物具有类似的合成途径和催化酶，同时葎草酮的合成也可为其它天然产物的合成提供示例，以为生物合成天然产物数量群的壮大贡献一份力量。或许葎草酮的生物合成还能用作它途，如与其它化合物的生物合成途径结合，以生产合成出具有靶标针对性的，药物作用更为强大和治疗更为精确的药物。1.3.2本课题研究方案本课题以实验室保存的含部分甲羟戊酸（MVA）下游途径的大肠杆菌Trc-low为出发菌株，设计并合成所需基因，再利用基因重组技术，将葎草酮的天然代谢途径引入Trc-low菌株中，构建出生产葎草酮的工程菌株，通过发酵技术表达合成出葎草酮产物，完整的课题研究技术路线如图1-2所示。（1）以实验室保存的含部分甲羟戊酸（MVA）下游途径的大肠杆菌Trc-low为出发菌株；（2）设计葎草酮合成代谢途径和方案，并确定合适的酶基因，在已知酶基因的基础上加上其它所需表达元件；（3）合成葎草酮代谢途径所需酶基因，并构建到合适的质粒载体上；（4）将表达载体导入大肠杆菌Trc-low中，通过摇瓶发酵进行表达生产葎草酮；（5）分离出发酵产物，并对其进行分子量和结构的鉴定，以验证代谢途径的可行性和正确性；（6）改变菌株发酵条件，以达到优化菌株生产葎草酮的目的；（7）放大菌株的发酵水平，以期达到增量生产葎草酮。图1-3研究技术路线Fig.1-3Technologyroutefortheresearch
青岛科技大学研究生学位论文232.3.1.2pACYDuet-1-CCL2-VPS-PT2表达载体设计依据实验室现存质粒，以及各种质粒载体的表达特性，实验选择了pACYDuet-1质粒载体，它是大肠杆菌宿主内的一种常见的蛋白双基因表达载体，还具有构建实验所需的两个多克隆位点，本身含有的启动子为T7启动子，在宿主细胞中高表达是它的优良特性，而氯霉素抗性是它本身自带的。研究过程中之所以选择pACYDuet-1质粒搭载CCL2-VPS-PT2基因片段，是因为它的高表达性，可以更好的表达质粒上连接的三个重要酶：戊-苯酮合酶（VPS）、羧基辅酶A连接酶（CCL2）、异戊二烯基转移酶-2（PT2），以利于产物的生成。选择好合适的质粒后，需要根据质粒碱基序列和目的基因碱基序列的特性来进行合理的设计，pACYDuet-1质粒载体已知包含有两个多克隆位点，即有了两处可以连接目的基因片段的位置，且质粒上已经具备了基本的目的基因表达元件T7启动子和RBS位点等，将羧基辅酶A连接酶（CCL2）以及异戊二烯基转移酶-2（PT2）分别克隆到两个多克隆位点，再克隆已经设计好的戊-苯酮合酶（VPS）到已经连接了羧基辅酶A连接酶（CCL2）的多克隆位点，最后，得到了一个完整的包含了我们所需要的三个目的基因的表达载体，构建的表达载体的具体片段特征已经表示下图中。图2-1pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2表达载体Fig.2-1TheexpressionvectorofpACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT22.3.2pTrcHis2B-IDI-PT1-Monooxygenase载体的构建2.3.2.1基因和载体的设计（1）IDI基因的设计根据啤酒花中葎草酮的代谢途径，目标产物葎草酮的合成过程中需要添加二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）到间苯三酚衍生物间苯异戊二酮（PIVP）上。因此，
本文编号：3598251
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3598251.html
最近更新
教材专著
