诱导型启动子cbh1在高山被孢霉中的应用研究
发布时间：2022-02-08 23:56
外切葡聚糖纤维二糖水解酶I基因（cellobiohydrolase I,cbh1）的启动子是一个受纤维素诱导的强诱导型启动子,可以实现目的基因定时、定量的表达,被认为是构建真核表达载体的理想选择,也是目前唯一被报道应用于丝状真菌CRISPR系统的诱导型启动子。产油真菌高山被孢霉（Mortierella alpina）在工业上被用于生产花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）,其发酵过程可以明显分为细胞增殖期和脂质积累期两个阶段。然而,目前常规的组成型启动子无法根据高山被孢霉的发酵产脂特点对目的基因进行人为地高效调控,条件性地控制基因表达的工具亟待开发。本论文以ω-3脂肪酸脱饱和酶基因oPpFADS17作为报告基因,通过构建含有异源诱导型启动子cbh1的高山被孢霉重组菌株MA-Pcbh1-oPp FADS17,探究了诱导型启动子cbh1在高山被孢霉中应用的可行性并对其诱导条件进行多方面的优化。此外,还通过基于GC-MS的代谢组学研究方法对重组菌的代谢物进行分析,确定了启动子cbh1诱导活性变化的生物标志物。本文的主要结果如下:1.在野生型高山被孢霉ATCC 32222基因组数...
【文章来源】：江南大学江苏省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纤维素酶对纤维素的降解过程
江南大学硕士学位论文10导型启动子。因此，本研究尝试将启动子cbh1应用于高山被孢霉，为高山被孢霉的基础研究和工程菌株的开发提供高效调控基因表达的分子工具。1.4.2主要研究内容本课题的主要研究内容如下：1．通过对文献进行查阅确定纤维素在降解过程中涉及的纤维素酶并对高山被孢霉全基因组信息和转录组测序数据进行分析，查找其是否具有纤维素代谢相关酶基因并分析各个基因是否有转录。同时，将高山被孢霉在以微晶纤维素唯一碳源的培养基中进行培养，观察菌株对纤维素的利用情况，进一步确定高山被孢霉对纤维素的代谢能力。2．以ω-3脂肪酸脱饱和酶基因oPpFADS17为报告基因，构建重组质粒pBIG2-ura5s-Pcbh1-oPpFADS17-Trpct，并利用根癌农杆菌介导的转化方法将重组质粒转入高山被孢霉中，通过对重组菌EPA含量及oPpFADS17基因的转录水平确定启动子cbh1在高山被孢霉中的诱导性。3．针对高山被孢霉重组菌株诱导培养时的诱导剂种类、诱导剂浓度及额外碳源葡萄糖的浓度对诱导条件进行优化。4．通过对高山被孢霉重组菌株的代谢产物进行分析，探究启动子cbh1对高山被孢霉重组菌株的影响并确定具有关键诱导作用的代谢物。技术路线如图1-3所示。图1-3技术路线图Figure.1-3Technologyroadmap
江南大学硕士学位论文 3.1.1.2 高山被孢霉在添加纤维素培养基中的生长分析 为了进一步确定高山被孢霉对纤维素代谢能力，将野生型高山被孢霉接种于以微晶纤维素作为唯一碳源的 Broth 培养基中，以不含微晶纤维素的 Broth 培养基作为阴性对照。28℃培养 7 天后，收集菌体测定生物量。在培养过程中，观察到随着高山被孢霉培养时间的延长，不溶性的微晶纤维素的含量在不断减少。添加微晶纤维素组的高山被孢霉产生的生物量明显高于对照组，提高了大约 50%（图 3-1），表明高山被孢霉可以降解利用纤维素并将其用于菌体的生长，纤维素代谢相关基因在高山被孢霉中进行了翻译表达，菌株中合成了可以分解纤维素的酶，高山被孢霉具备启动子 cbh1 应用的生物基础。
【参考文献】：
期刊论文
[1]丝状真菌纤维素酶合成诱导及转录调控[J]. 张飞,白凤武,赵心清. 生物工程学报. 2016(11)
[2]内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究进展[J]. 黄国昌,熊大维,顾斌涛. 江西科学. 2016(01)
[3]真菌产纤维素酶的诱导物及其调控机理研究进展[J]. 谢天文,刘晓风,袁月祥,闫志英,贺蓉娜,廖银章. 应用与环境生物学报. 2010(03)
[4]工业发酵中溶氧因素的探讨[J]. 张智,滕婷婷,王淼,邵菊芳. 中国酿造. 2008(23)
[5]重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达[J]. 刘顺谊,殷志敏. 南京师大学报(自然科学版). 2007(04)
博士论文
[1]Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用[D]. 史海粟.江南大学 2016
[2]高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究[D]. 郝光飞.江南大学 2014
[3]产油真菌高山被孢霉的脂质合成机理研究[D]. 王鸿超.江南大学 2013
硕士论文
[1]铁胁迫及强启动子A4插入对黄色链霉菌TRM45540次生代谢的影响[D]. 杨帅.塔里木大学 2019
[2]长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达[D]. 王越.江南大学 2019
[3]双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究[D]. 张小可.江南大学 2018
[4]高山被孢霉生物合成共轭亚油酸重组菌株的构建及研究[D]. 郝丹辉.江南大学 2015
[5]启动子cbh1的改造与里氏木霉通用质粒载体的构建[D]. 唐偲洋.华东理工大学 2013
[6]多拷贝策略构建瑞氏木霉外源基因系列表达载体[D]. 刘倜.山东大学 2005
[7]分泌性表达人rPA毕赤酵母菌株的构建及发酵条件的优化[D]. 邓长江.山东大学 2005
本文编号：3615995
【文章来源】：江南大学江苏省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纤维素酶对纤维素的降解过程
江南大学硕士学位论文10导型启动子。因此，本研究尝试将启动子cbh1应用于高山被孢霉，为高山被孢霉的基础研究和工程菌株的开发提供高效调控基因表达的分子工具。1.4.2主要研究内容本课题的主要研究内容如下：1．通过对文献进行查阅确定纤维素在降解过程中涉及的纤维素酶并对高山被孢霉全基因组信息和转录组测序数据进行分析，查找其是否具有纤维素代谢相关酶基因并分析各个基因是否有转录。同时，将高山被孢霉在以微晶纤维素唯一碳源的培养基中进行培养，观察菌株对纤维素的利用情况，进一步确定高山被孢霉对纤维素的代谢能力。2．以ω-3脂肪酸脱饱和酶基因oPpFADS17为报告基因，构建重组质粒pBIG2-ura5s-Pcbh1-oPpFADS17-Trpct，并利用根癌农杆菌介导的转化方法将重组质粒转入高山被孢霉中，通过对重组菌EPA含量及oPpFADS17基因的转录水平确定启动子cbh1在高山被孢霉中的诱导性。3．针对高山被孢霉重组菌株诱导培养时的诱导剂种类、诱导剂浓度及额外碳源葡萄糖的浓度对诱导条件进行优化。4．通过对高山被孢霉重组菌株的代谢产物进行分析，探究启动子cbh1对高山被孢霉重组菌株的影响并确定具有关键诱导作用的代谢物。技术路线如图1-3所示。图1-3技术路线图Figure.1-3Technologyroadmap
江南大学硕士学位论文 3.1.1.2 高山被孢霉在添加纤维素培养基中的生长分析 为了进一步确定高山被孢霉对纤维素代谢能力，将野生型高山被孢霉接种于以微晶纤维素作为唯一碳源的 Broth 培养基中，以不含微晶纤维素的 Broth 培养基作为阴性对照。28℃培养 7 天后，收集菌体测定生物量。在培养过程中，观察到随着高山被孢霉培养时间的延长，不溶性的微晶纤维素的含量在不断减少。添加微晶纤维素组的高山被孢霉产生的生物量明显高于对照组，提高了大约 50%（图 3-1），表明高山被孢霉可以降解利用纤维素并将其用于菌体的生长，纤维素代谢相关基因在高山被孢霉中进行了翻译表达，菌株中合成了可以分解纤维素的酶，高山被孢霉具备启动子 cbh1 应用的生物基础。
【参考文献】：
期刊论文
[1]丝状真菌纤维素酶合成诱导及转录调控[J]. 张飞,白凤武,赵心清. 生物工程学报. 2016(11)
[2]内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究进展[J]. 黄国昌,熊大维,顾斌涛. 江西科学. 2016(01)
[3]真菌产纤维素酶的诱导物及其调控机理研究进展[J]. 谢天文,刘晓风,袁月祥,闫志英,贺蓉娜,廖银章. 应用与环境生物学报. 2010(03)
[4]工业发酵中溶氧因素的探讨[J]. 张智,滕婷婷,王淼,邵菊芳. 中国酿造. 2008(23)
[5]重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达[J]. 刘顺谊,殷志敏. 南京师大学报(自然科学版). 2007(04)
博士论文
[1]Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用[D]. 史海粟.江南大学 2016
[2]高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究[D]. 郝光飞.江南大学 2014
[3]产油真菌高山被孢霉的脂质合成机理研究[D]. 王鸿超.江南大学 2013
硕士论文
[1]铁胁迫及强启动子A4插入对黄色链霉菌TRM45540次生代谢的影响[D]. 杨帅.塔里木大学 2019
[2]长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达[D]. 王越.江南大学 2019
[3]双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究[D]. 张小可.江南大学 2018
[4]高山被孢霉生物合成共轭亚油酸重组菌株的构建及研究[D]. 郝丹辉.江南大学 2015
[5]启动子cbh1的改造与里氏木霉通用质粒载体的构建[D]. 唐偲洋.华东理工大学 2013
[6]多拷贝策略构建瑞氏木霉外源基因系列表达载体[D]. 刘倜.山东大学 2005
[7]分泌性表达人rPA毕赤酵母菌株的构建及发酵条件的优化[D]. 邓长江.山东大学 2005
本文编号：3615995
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3615995.html
