酿酒酵母工程菌合成橙花叔醇的研究

发布时间：2022-02-19 15:07

　　萜类化合物在食品、医药和保健品等领域具有广泛应用。利用代谢工程技术异源合成各种萜类化合物是近年来的研究热点。倍半萜类化合物橙花叔醇是香料和精油中的重要成分,亦被应用于医药合成。在实验室前期基于二次生长-诱导系统构建的橙花叔醇合成菌的基础上,本论文对进一步提高酿酒酵母橙花叔醇产量进行了研究。根据以往研究报道,将转录因子Hac1、人细胞抗凋亡因子Bcl-2、还原型谷胱甘肽合酶Gsh1、分子伴侣Gros2、热应激蛋白Hsp104和Hap1六种不同的候选萜类合成促进因子的编码基因,分别在甲羟戊酸途径增强宿主菌YS037中进行过表达,测试他们对橙花叔醇合成的促进作用。结果表明,HAC1和BCL-2的过表达分别将橙花叔醇摇瓶产量提高了47.7%和77.7%。对所构建的一系列甲羟戊酸途径增强菌株的HAC1 m RNA水平进行了测定,发现所构建的菌株中发生了未折叠蛋白反应,而且他们的GAL1启动子的转录受到了抑制。过表达HAC1的菌株YS038在摇瓶发酵72 h后GAL1启动子转录活性提高了8.18倍,96 h后橙花叔醇产量提高47.7%,达到497 mg/L。过表达BCL-2的菌株YS039在发酵7... 

【文章来源】：浙江工业大学浙江省

【文章页数】：95 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 萜类化合物简介
    1.2 萜类化合物的应用
    1.3 萜类化合物的生产方法
        1.3.1 天然提取和化学法合成萜类化合物
        1.3.2 代谢工程方法生物合成萜类化合物
    1.4 酵母细胞工厂对胁迫的耐受性
        1.4.1 高乙醇浓度
        1.4.2 高温与高渗透压
        1.4.3 代谢毒性
        1.4.4 蛋白质压力
        1.4.5 氧胁迫作用
    1.5 本课题的研究内容及意义
第二章 酵母工程菌萜类物质合成促进因子的筛选
    2.1 前言
    2.2 试验设备与材料
        2.2.1 仪器设备
        2.2.2 质粒菌株
        2.2.3 试剂与引物
        2.2.4 生化试剂与培养基配方
    2.3 实验方法
        2.3.1 分子生物学实验操作方法
        2.3.2 酿酒酵母感受态制备及转化
        2.3.3 不同候选促进因子表达载体的构建
        2.3.4 摇瓶双相发酵与橙花叔醇测定
        2.3.5 统计方法
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 高表达不同候选萜类合成促进因子的菌株构建
        2.4.2 不同候选促进因子对橙花叔醇合成的作用
    2.5 本章小结
第三章 过表达转录因子Hac1提高工程酵母橙花叔醇产量
    3.1 前言
    3.2 试验设备与材料
        3.2.1 仪器设备
        3.2.2 质粒菌株
        3.2.3 试剂与引物
        3.2.4 生化试剂与培养基配方
    3.3 实验方法
        3.3.1 分子生物学实验操作方法
        3.3.2 酿酒酵母感受态制备及转化
        3.3.3 HAC1不同表达方式的载体构建
        3.3.4 酿酒酵母荧光定量PCR
        3.3.5 摇瓶双相发酵与橙花叔醇测定
        3.3.6 统计方法
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 HAC1 基因PCR验证
        3.4.2 过表达HAC1对橙花叔醇合成的作用
        3.4.3 过表达HAC1 对细胞活力、ROS的影响
        3.4.4 已构建菌株中剪接的HAC1、GAL1和AcNES1 的转录水平测定
        3.4.5 过表达HAC1对Ac NES1、GAL1 转录水平的影响
    3.5 本章小结
第四章 Bcl-2蛋白促进工程菌橙花叔醇合成
    4.1 前言
    4.2 试验设备与材料
        4.2.1 仪器设备
        4.2.2 质粒菌株
        4.2.3 试剂与引物
        4.2.4 生化试剂与培养基配方
    4.3 实验方法
        4.3.1 分子生物学实验操作方法
        4.3.2 感受态制备及转化
        4.3.3 BCL-2不同表达方式的载体构建
        4.3.4 酿酒酵母荧光定量PCR及转录组分析
        4.3.5 摇瓶双相发酵与橙花叔醇测定
        4.3.6 统计方法
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 BCL-2 基因PCR验证
        4.4.2 过表达BCL-2对橙花叔醇合成的作用
        4.4.3 过表达BCL-2 对细胞活力、ROS的影响
        4.4.4 过表达BCL-2对Ac NES1、GAL1、GAL4 转录水平的影响
        4.4.5 对过表达HAC1、BCL-2 菌株的基因转录组分析
    4.5 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介
    1 作者简历
    2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
    3 参与的科研项目及获奖情况
    4 发明专利
学位论文数据集


【参考文献】：
期刊论文
[1]高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建[J]. 张丽丽,马晓琳,王冬,郁彭,黄璐琦,张学礼,戴住波.  中国中药杂志. 2017(15)
[2]我国聚异戊二烯橡胶生产技术进展及市场分析[J]. 李玉芳,伍小明.  上海化工. 2015(01)
[3]替普瑞酮合成工艺的改进[J]. 陈海荣,胡宗琳.  中国医药工业杂志. 2004(08)
[4]β-胡萝卜素的抗氧化作用与疾病预防[J]. 范晓岚,杨军,糜漫天,杨慧.  中国公共卫生. 2003(04)



本文编号：3633125