辅因子代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸

发布时间：2022-05-08 17:15

　　L-精氨酸是一种具有多种特殊生理生化功能的半必需氨基酸,在医药、食品和保健品等领域应用广泛。Corynebacterium glutamicum SNK118是一株经过多次诱变筛选获得的L-精氨酸工业生产菌株,5-L发酵罐补料分批发酵可产L-精氨酸40.47 g·L^?1。本研究通过全基因组测序对C.glutamicum SNK118的遗传背景进行系统分析,并对其L-精氨酸合成途径和调控机制进行研究,基于辅因子工程改造C.glutamicum SNK118提高L-精氨酸的生产效率。（1）为提高L-精氨酸生产途径中的关键辅酶Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate（NADPH）的供给,将大肠杆菌来源的pntAB（嘧啶核苷酸转氢酶）和C.glutamicum ATCC13032来源的ppnK（NAD⁺激酶）进行串联表达,构建谷氨酸棒杆菌JML03。在补料分批发酵80 h后,JML03菌株的L-精氨酸产量为61.13 g·L^?1,糖酸转化率为0.34 g·g^-1... 

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 L-精氨酸的概述
        1.1.1 L-精氨酸的理化性质
        1.1.2 L-精氨酸的生理功能及应用
        1.1.3 L-精氨酸的生产方法
    1.2 谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的概述
        1.2.1 谷氨酸棒杆菌的简介
        1.2.2 谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的代谢合成途径
        1.2.3 谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的代谢调控机制
    1.3 代谢工程育种
        1.3.1 代谢工程概述
        1.3.2 辅因子代谢工程
        1.3.3 谷氨酸棒杆菌基因敲除载体现状
    1.4 本课题研究的背景、意义和主要内容
        1.4.1 本课题的来源
        1.4.2 本课题研究的背景及意义
        1.4.3 本课题研究的主要内容
第二章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 实验所用引物
        2.1.3 实验仪器设备
        2.1.4 实验试剂
        2.1.5 主要培养基和溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 异源基因表达质粒的构建
        2.2.2 异源基因表达菌株的构建
        2.2.3 敲除质粒的构建
        2.2.4 敲除菌株的构建
        2.2.5 谷氨酸棒杆菌的摇瓶发酵
        2.2.6 谷氨酸棒杆菌的补料分批发酵
        2.2.7 菌体生长量、葡萄糖含量、精氨酸浓度等发酵参数的测定
        2.2.8 嘧啶核苷酸转氢酶活性测定
        2.2.9 胞内辅酶浓度的测定
第三章 结果与讨论
    3.1 谷氨酸棒杆菌重组菌的构建
        3.1.1 异源基因表达菌株的构建
        3.1.2 敲除菌株的构建
        3.1.3 高产L-精氨酸谷氨酸棒杆菌重组菌的构建
    3.2 异源基因表达对L-精氨酸发酵的影响
        3.2.1 pntAB的异源表达对菌株合成L-精氨酸的影响
        3.2.2 ppnK的异源表达对菌株合成L-精氨酸的影响
        3.2.3 pntAB和ppnK串联表达对菌株合成L-精氨酸的影响
    3.3 基因敲除对L-精氨酸发酵的影响
        3.3.1 argR的敲除对菌株合成L-精氨酸的影响
        3.3.2 farR的敲除对菌株合成L-精氨酸的影响
        3.3.3 ldh的敲除对菌株合成L-精氨酸的影响
    3.4 高产L-精氨酸谷氨酸棒杆菌重组菌的发酵
主要结论和展望
    主要结论
    展望
参考文献
致谢
附录1：实验中所用的引物
附录2：标准曲线
    NADPH标准曲线
    NADP~+标准曲线
    葡萄糖标准曲线
    L-精氨酸标准曲线
附录3：作者在攻读硕士期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]L-精氨酸生物合成机制及其代谢工程育种研究进展[J]. 程功,徐建中,张伟国.  微生物学通报. 2016(06)
[2]一种载体构建的新方法:重组融合PCR法[J]. 邝翡婷,袁定阳,李莉,李新奇.  基因组学与应用生物学. 2012(06)
[3]谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用[J]. 还晓静,李坤,史锋,王小元.  生物工程学报. 2012(09)
[4]生产L-精氨酸的脯氨酸营养缺陷型菌株的选育[J]. 陈晓博,罗雪粤,张淑荣,张鹏.  北京化工大学学报(自然科学版). 2011(06)
[5]从头发中提取L-精氨酸的研究[J]. 尹刚明,李冰,蔡妙颜,唐德松,欧阳玉祝.  现代食品科技. 2008(09)
[6]发酵液中L-精氨酸的检测方法[J]. 贺小贤,孙莹,陈合.  食品与药品. 2007(01)
[7]L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制[J]. 许正宏,熊筱晶,窦文芳,陶文沂.  工业微生物. 2006(04)
[8]N+注入L-精氨酸产生菌诱变育种的研究[J]. 赵俊平,黄继红,和晶亮,王新春,王华南.  发酵科技通讯. 2006(02)
[9]发酵液中L-精氨酸定量检测方法的研究[J]. 郝刚,钱和.  食品工业科技. 2005(02)
[10]L-精氨酸高产菌的诱变育种及其摇瓶产酸条件[J]. 熊筱晶,窦文芳,许正宏,陶文沂.  无锡轻工大学学报(食品与生物技术). 2003(02)

硕士论文
[1]Gibson Assembly方法的构建及MEP途径的组合优化[D]. 刘乐山.上海医药工业研究院 2017
[2]谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建[D]. 谭延振.江南大学 2012



本文编号：3652055