碳链延长酶GALS的定向进化和在人工生态中的潜在应用价值

发布时间：2022-12-04 06:52

　　地球上的一碳类资源有很多种,其中甲醇和甲醛作为生物代谢的基本中间产物之一,它们来源广泛且廉价易得,是一种重要的底物原料。将来源于恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶进行改造,获得了活性高的突变菌株乙醇醛合酶（Glycolaldehyde synthase,GALS）,可以催化实现甲醛的二聚反应,产物是乙醇醛,而乙醇醛是生命代谢活动的重要中间产物,在生物生命活动中参与多种反应,在日常生活中也有很多应用。利用GALS设计了两条代谢途径,但两个反应过程的关键限制酶是GALS,因此提高GALS的酶活性,可以显著地提高甲醛的利用效率,不仅对设计的两条代谢途径尤为重要,而且还为后续的研究打下基础。为此,在前期研究中,实验室通过定点突变的方式,用高通量筛选的方法,获得了高活性的突变体。设计的第一条途径是从甲醇出发,利用甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenase,BmMDH）、GALS和醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,aLdA）经过三步催化反应生成乙醇酸,乙醇酸可以参与生物体内三羧酸循环等代谢途径被生物利用。为了实现该途径,首先将该过程中的关键酶BmMDH、GALS和aL... 

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 人工生态循环
        1.1.1 生物质新能源与地球大气
        1.1.2 人工生态循环的设计
    1.2 生物催化途径
        1.2.1 生物催化技术概念
        1.2.2 生物催化技术特点
        1.2.3 催化元件
        1.2.4 人工和计算机设计合成途径
        1.2.5 生物催化与合成生物学
    1.3 一碳资源的利用
        1.3.1 二氧化碳的来源和利用
        1.3.2 甲醇的来源与利用
        1.3.3 甲醛的来源与利用
    1.4 乙醇酸
        1.4.1 乙醇酸的概述
        1.4.2 乙醇酸的性质与应用
        1.4.3 乙醇酸的国内外研究进展
    1.5 木糖
        1.5.1 木糖的概述
        1.5.2 木糖的性质与应用
        1.5.3 木糖的国内外研究进展
    1.6 一碳资源的研究背景
    1.7 一碳资源研究的内容与意义
    1.8 研究的技术路线
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种与质粒
        2.1.2 实验相关试剂
            2.1.2.1 常用化学试剂
            2.1.2.2 工具酶及试剂盒
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 实验相关培养基及缓冲液
            2.1.4.1 培养基及试剂
            2.1.4.2 缓冲液
            2.1.4.3 核酸胶和蛋白胶配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组质粒的构建
            2.2.1.1 突变体构建
            2.2.1.2 突变体PCR扩增
            2.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测
            2.2.1.4 核酸胶回收
            2.2.1.5 PCR产物的消化
            2.2.1.6 PCR产物的纯化
            2.2.1.7 Gibson连接
            2.2.1.8 化学转化
            2.2.1.9 突变结果验证
            2.2.1.10 质粒提取方法
        2.2.2 电转感受态细胞的制作
        2.2.3 双质粒共转
    2.3 酶的功能表征方法
        2.3.1 蛋白的表达
        2.3.2 蛋白的纯化
        2.3.3 SDS-PAGE检测
        2.3.4 蛋白浓度测定
        2.3.5 酶的催化体系
        2.3.6 样品检测体系
            2.3.6.1 羟基乙醛检测
            2.3.6.2 乙醇酸检测
            2.3.6.3 稀有糖检测
    2.4 酶的定向进化
        2.4.1 突变体构建
        2.4.2 高通量筛选方法的确定
第3章 结果与分析
    3.1 酶的定向进化
        3.1.1 筛选步骤
        3.1.2 初筛结果
        3.1.3 复筛结果
        3.1.4 酶活表征
    3.2 甲醇到乙醇酸途径的构建
        3.2.1 甲醇合成乙醇酸途径
        3.2.2 途经相关酶的功能表征
        3.2.3 乙醇酸的体外合成
        3.2.4 体内途径构建
            3.2.4.1 生长结果
            3.2.4.2 胞内C13标记结果
    3.3 甲醛到L-木糖途径的构建
        3.3.1 质粒的构建与克隆
        3.3.2 途经相关酶的表达与纯化
        3.3.3 木糖通路的构建
        3.3.4 酶法催化甲醛合成木糖
        3.3.5 目标产物木糖的检测
        3.3.6 木糖途径的优化
            3.3.6.1 途径第一步酶的确定
            3.3.6.2 途径酶的催化效率
            3.3.6.3 底物浓度与酶比例的优化
第4章 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 论文创新点
    5.3 展望
参考文献
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]生物催化甲醛生成L-木糖[J]. 初斋林,逯晓云,刘玉万,崔博,靖美东,江会锋.  生物工程学报. 2020(05)
[2]乙醇酸在水中溶解度的测定与关联[J]. 陈亮.  精细石油化工. 2020(01)
[3]CuO/Er-Yb-TiO2的制备及在模拟可见光下催化CO2合成甲醇[J]. 肖洒,谈恒,吴珊妮,曾敏,熊春荣.  材料导报. 2020(02)
[4]大气二氧化碳浓度增加对木本植物BVOCs释放的影响[J]. 赖金美,潘若琪,刘燕飞,黄幸然,方熊,靳少非,易志刚.  生态学杂志. 2020(03)
[5]木糖及氧化猪脂对热反应产物滋味的影响及滋味活性肽组分分离[J]. 王天泽,杜文斌,谭佳,赵健,谢建春.  中国食品学报. 2019(12)
[6]市县级废弃物处理温室气体清单编制研究——以清远为例[J]. 侯坚,冯丹燕,雷蕾.  绿色科技. 2019(14)
[7]生物催化技术在化学制药中的应用[J]. 季爱云,李子跃.  化工管理. 2019(21)
[8]木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究[J]. 凌翓,纪明华,段海燕,史吉平,孙俊松.  生物技术通报. 2019(06)
[9]室内空气甲醛污染相关问题研究进展[J]. 梁雪松,殷明杰,刘晓秋,道书润,赵瑞.  中国公共卫生管理. 2019(03)
[10]地球上奇特地貌的形成过程[J]. 栾崧,曹建文,赵良杰,卢海平.  中国矿业. 2019(S1)

硕士论文
[1]毕赤酵母表达体系对功能性酶的表达研究[D]. 霍辰青.北京化工大学 2014



本文编号：3707797