谷氨酸棒杆菌PhoPR双组分系统响应溶氧变化的调控机制研究
发布时间：2022-12-05 06:25
谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum）是一种重要的工业生产菌株,广泛应用于氨基酸、有机酸、药用蛋白等产品的大规模生产。在C.glutamicum工业化好氧发酵过程中,溶氧（dissolved oxygen,DO）是一个重要的控制参数,影响着目的产物的产量和质量。然而目前针对溶氧的研究主要在于控制策略的优化,对于溶氧响应机制的研究尚不清晰。本研究发现PhoPR双组分系统（two-component system,TCS）在C.glutamicum中能够响应溶氧水平变化,并以此对PhoPR TCS响应外界溶氧变化的规律和功能机制进行了研究。通过分析不同溶氧条件下C.glutamicum胞内基因的转录水平变化,发现PhoPR为C.glutamicum在不同溶氧水平下转录变化最明显的TCS。通过融合表达PhoPR启动子区和gfp基因,发现融合表达菌株在不同氧气浓度（正常氧、微需氧、无氧）环境下显示出不同的绿色荧光强度,且低氧环境下菌株的荧光水平更高,确定C.glutamicum中的PhoPR TCS能够感应环境中的氧气变化。通过实时荧光...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 谷氨酸棒状杆菌的工业发酵应用
1.1.1 谷氨酸棒状杆菌的工业应用
1.1.2 工业发酵中的溶氧控制
1.2 原核及真核细胞中氧气响应机制的研究
1.3 双组分系统及其研究进展
1.3.1 双组分系统简介
1.3.2 TCS响应氧气变化并参与氧化应激响应的研究
1.3.3 不同菌株中PhoPR TCS的功能研究
1.4 C.glutamicum的胞内能量代谢调控
1.4.1 C.glutamicum中的能量代谢转录调控
1.4.2 C.glutamicum中的能量代谢途径
1.4.3 C.glutamicum中的电子传递链
1.5 课题研究内容
1.5.1 课题来源和意义
1.5.2 本课题的主要研究内容
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株、质粒和引物
2.1.2 培养基和培养条件
2.1.3 主要溶液的配制
2.1.4 主要试剂、试剂盒和耗材
2.1.5 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 热击法转化E.coli感受态细胞
2.2.2 电击法转化C.glutamicum感受态细胞
2.2.3 转录组及PhoPR基因分析
2.2.4 融合PhoPR基因启动子区的gfp基因表达载体的构建
2.2.5 不同溶氧条件下C.glutamicum的绿色荧光强度鉴定
2.2.6 PhoPR TCS的生物信息学分析
2.2.7 PhoPR敲除及过表达菌株的构建
2.2.8 C.glutamicum不同菌株RNA的提取和反转录
2.2.9 RT-qPCR分析目标基因的转录水平
2.2.10 PhoP蛋白表达载体的构建
2.2.11 PhoP蛋白的表达和纯化
2.2.12 SDS-PAGE分析PhoP蛋白的表达和纯化结果
2.2.13 EMSA实验分析PhoP蛋白与目标基因之间的相互作用关系
2.2.14 效应蛋白PhoP的保守结合序列分析预测
2.2.15 C.glutamicum不同菌株中NAD+/NADH的检测
2.2.16 C.glutamicum不同菌株的生长曲线及胞内ATP测定
第三章 结果与讨论
3.1 PhoPR TCS响应外界溶氧变化的规律探究
3.1.1 不同溶氧条件下C.glutamicum中 TCS的转录水平变化
3.1.2 不同溶氧条件下PhoPR启动子区融合GFP蛋白的荧光强度比较
3.2 PhoPR TCS的生物信息学分析
3.2.1 PhoPR TCS的基因结构分析
3.2.2 不同物种中PhoP蛋白的系统发育分析
3.3 PhoPR TCS在 C.glutamicum中的调控规律研究
3.3.1 PhoPR TCS敲除和过表达菌株的构建
3.3.2 PhoP蛋白的表达和纯化
3.3.3 PhoPR TCS与 C.glutamicum中转录因子之间的调控规律研究
3.3.4 PhoPR TCS对 C.glutamicum中能量代谢的调控规律研究
3.3.5 PhoPR TCS对 C.glutamicum中电子传递链基因的调控规律研究
3.3.6 PhoPR TCS对 C.glutamicum中细胞膜相关基因的调控规律研究
3.3.7 效应蛋白PhoP的保守结合序列分析预测
3.4 PhoPR TCS对 C.glutamicum细胞生理特性的影响
3.4.1 PhoPR TCS对胞内NAD+/NADH水平的影响
3.4.2 PhoPR TCS对细胞生长及胞内ATP水平的影响
3.5 C.glutamicum中 PhoPR TCS应对外界低溶氧环境的调控机制分析
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附表:本研究所用引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]微生物发酵中溶氧浓度的控制研究[J]. 李昶志,潘忠成,翁婧,李蒲民. 绿色科技. 2019(06)
[2]遗传算法优化CGXⅡ培养基提高谷氨酸棒状杆菌产L-精氨酸[J]. 王震,张豪,郑穗平. 中国酿造. 2019(03)
[3]代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌合成及分泌途径生产L-缬氨酸[J]. 张海灵,李颜颜,王小元. 生物工程学报. 2018(10)
[4]谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展[J]. 杨阳,张苗苗,高越,郭晓鹏,李文建,冷非凡,陆栋. 食品工业科技. 2019(05)
[5]Sigma因子高效调控微生物多功能研究进展[J]. 胡莉,谭泽文,郜晨,谭习羽,谭志远. 生命科学. 2018(03)
[6]敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响[J]. 薛宁,李智祥,战俊杰,赵磊,梁云龙,冯甲,刘涛,徐庆阳,张成林,陈宁. 食品与发酵工业. 2017(08)
[7]原核生物RNA聚合酶辅助因子σ因子的研究进展[J]. 徐江涛,刘晓青,田健,伍宁丰. 中国农业科技导报. 2017(01)
[8]全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸[J]. 陈诚,李颜颜,尹良鸿,胡瑾瑜,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(09)
[9]微生物发酵过程中溶氧的影响及其调控[J]. 赵宇,陈忠敏. 食品与发酵科技. 2016(04)
[10]细菌全局性调控因子CsrA功能及其作用机制研究进展[J]. 尚立国,战嵛华,弓湃,燕永亮. 中国农业科技导报. 2014(04)
硕士论文
[1]乙醛酸循环途径对谷氨酸棒杆菌两阶段发酵生产丁二酸的影响[D]. 王莉.浙江大学 2013
本文编号：3709864
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 谷氨酸棒状杆菌的工业发酵应用
1.1.1 谷氨酸棒状杆菌的工业应用
1.1.2 工业发酵中的溶氧控制
1.2 原核及真核细胞中氧气响应机制的研究
1.3 双组分系统及其研究进展
1.3.1 双组分系统简介
1.3.2 TCS响应氧气变化并参与氧化应激响应的研究
1.3.3 不同菌株中PhoPR TCS的功能研究
1.4 C.glutamicum的胞内能量代谢调控
1.4.1 C.glutamicum中的能量代谢转录调控
1.4.2 C.glutamicum中的能量代谢途径
1.4.3 C.glutamicum中的电子传递链
1.5 课题研究内容
1.5.1 课题来源和意义
1.5.2 本课题的主要研究内容
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株、质粒和引物
2.1.2 培养基和培养条件
2.1.3 主要溶液的配制
2.1.4 主要试剂、试剂盒和耗材
2.1.5 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 热击法转化E.coli感受态细胞
2.2.2 电击法转化C.glutamicum感受态细胞
2.2.3 转录组及PhoPR基因分析
2.2.4 融合PhoPR基因启动子区的gfp基因表达载体的构建
2.2.5 不同溶氧条件下C.glutamicum的绿色荧光强度鉴定
2.2.6 PhoPR TCS的生物信息学分析
2.2.7 PhoPR敲除及过表达菌株的构建
2.2.8 C.glutamicum不同菌株RNA的提取和反转录
2.2.9 RT-qPCR分析目标基因的转录水平
2.2.10 PhoP蛋白表达载体的构建
2.2.11 PhoP蛋白的表达和纯化
2.2.12 SDS-PAGE分析PhoP蛋白的表达和纯化结果
2.2.13 EMSA实验分析PhoP蛋白与目标基因之间的相互作用关系
2.2.14 效应蛋白PhoP的保守结合序列分析预测
2.2.15 C.glutamicum不同菌株中NAD+/NADH的检测
2.2.16 C.glutamicum不同菌株的生长曲线及胞内ATP测定
第三章 结果与讨论
3.1 PhoPR TCS响应外界溶氧变化的规律探究
3.1.1 不同溶氧条件下C.glutamicum中 TCS的转录水平变化
3.1.2 不同溶氧条件下PhoPR启动子区融合GFP蛋白的荧光强度比较
3.2 PhoPR TCS的生物信息学分析
3.2.1 PhoPR TCS的基因结构分析
3.2.2 不同物种中PhoP蛋白的系统发育分析
3.3 PhoPR TCS在 C.glutamicum中的调控规律研究
3.3.1 PhoPR TCS敲除和过表达菌株的构建
3.3.2 PhoP蛋白的表达和纯化
3.3.3 PhoPR TCS与 C.glutamicum中转录因子之间的调控规律研究
3.3.4 PhoPR TCS对 C.glutamicum中能量代谢的调控规律研究
3.3.5 PhoPR TCS对 C.glutamicum中电子传递链基因的调控规律研究
3.3.6 PhoPR TCS对 C.glutamicum中细胞膜相关基因的调控规律研究
3.3.7 效应蛋白PhoP的保守结合序列分析预测
3.4 PhoPR TCS对 C.glutamicum细胞生理特性的影响
3.4.1 PhoPR TCS对胞内NAD+/NADH水平的影响
3.4.2 PhoPR TCS对细胞生长及胞内ATP水平的影响
3.5 C.glutamicum中 PhoPR TCS应对外界低溶氧环境的调控机制分析
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附表:本研究所用引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]微生物发酵中溶氧浓度的控制研究[J]. 李昶志,潘忠成,翁婧,李蒲民. 绿色科技. 2019(06)
[2]遗传算法优化CGXⅡ培养基提高谷氨酸棒状杆菌产L-精氨酸[J]. 王震,张豪,郑穗平. 中国酿造. 2019(03)
[3]代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌合成及分泌途径生产L-缬氨酸[J]. 张海灵,李颜颜,王小元. 生物工程学报. 2018(10)
[4]谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展[J]. 杨阳,张苗苗,高越,郭晓鹏,李文建,冷非凡,陆栋. 食品工业科技. 2019(05)
[5]Sigma因子高效调控微生物多功能研究进展[J]. 胡莉,谭泽文,郜晨,谭习羽,谭志远. 生命科学. 2018(03)
[6]敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响[J]. 薛宁,李智祥,战俊杰,赵磊,梁云龙,冯甲,刘涛,徐庆阳,张成林,陈宁. 食品与发酵工业. 2017(08)
[7]原核生物RNA聚合酶辅助因子σ因子的研究进展[J]. 徐江涛,刘晓青,田健,伍宁丰. 中国农业科技导报. 2017(01)
[8]全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸[J]. 陈诚,李颜颜,尹良鸿,胡瑾瑜,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(09)
[9]微生物发酵过程中溶氧的影响及其调控[J]. 赵宇,陈忠敏. 食品与发酵科技. 2016(04)
[10]细菌全局性调控因子CsrA功能及其作用机制研究进展[J]. 尚立国,战嵛华,弓湃,燕永亮. 中国农业科技导报. 2014(04)
硕士论文
[1]乙醛酸循环途径对谷氨酸棒杆菌两阶段发酵生产丁二酸的影响[D]. 王莉.浙江大学 2013
本文编号：3709864
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