Vibrio vulnificus和Rhodothemus obamensis分支酶的重组表达及其在制备改性淀粉中的应用

发布时间：2022-12-10 07:22

　　天然淀粉中抗性淀粉（RS）含量较低,大量摄入可引发代谢综合相关疾病,通过酶法改性得到的改性淀粉中RS含量有所提高,对人类生理健康具有极大益处。分支酶（branching enzyme）包括淀粉分支酶和糖原分支酶两大类,它能催化α-1,4键的断裂,形成α-1,6分支点,在改性淀粉制备中具有巨大应用潜能。本文对直链淀粉亲和性高且来源于Rhodothemus obamensis的淀粉分支酶（RoBE）和对支链淀粉亲和性高且来源于Vibrio vulnificus的糖原分支酶（VvGBE）在Escherichia coli BL21（DE3）中表达,研究它们的酶学性质及底物特异性,探究了制备改性淀粉的工艺条件,对改性淀粉产物的理化性质进行了分析。此外,将VvGBE在Bacillus subtilis WS11中进行表达,探索了启动子对其表达量的影响。主要研究结果如下:（1）将Vibrio vulnificus和Rhodothemus obamensis来源的分支酶基因在E.coli BL21（DE3）中表达,经摇瓶发酵,它们对支链淀粉的胞内酶活分别为2.06 U·mL^-1... 

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 淀粉的概述
        1.1.1 淀粉消化性分类
        1.1.2 改性淀粉的功能
        1.1.3 淀粉改性的方法
    1.2 分支酶的概述
        1.2.1 分支酶的来源及性质
        1.2.2 分支酶在改性淀粉制备中的应用
    1.3 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达系统的概述
        1.3.1 大肠杆菌表达系统的简介
        1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的简介
    1.4 立题依据及意义
    1.5 本论文的研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要培养基
    2.2 分子生物学操作方法
        2.2.1 重组E.coli质粒的构建
        2.2.2 重组B.subtilis质粒的构建
        2.2.3 不同启动子表达质粒的构建
        2.2.4 E.coli感受态的制备及热激法转化
        2.2.5 B.subtilis感受态的制备及电击法转化
    2.3 发酵方法
        2.3.1 重组E.coli的摇瓶发酵
        2.3.2 重组B.subtilis的摇瓶发酵
    2.4 分析方法
        2.4.1 菌体浓度的测定
        2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
        2.4.3 分支酶酶活的测定
        2.4.4 蛋白浓度的测定
        2.4.5 分支酶的纯化及酶学性质分析
    2.5 改性淀粉的制备工艺及理化性质分析
        2.5.1 单酶法制备改性淀粉的工艺
        2.5.2 双酶法制备改性淀粉的工艺
        2.5.3 体外消化性能分析
        2.5.4 高效阴离子交换色谱分析
        2.5.5 高效凝胶过滤色谱分析
        2.5.6 质子核磁共振光谱学分析
第三章 结果与讨论
    3.1 分支酶在E.coli中的克隆表达及酶学性质研究
        3.1.1 分支酶在E.coli中的克隆表达
        3.1.2 重组分支酶的纯化
        3.1.3 重组分支酶的生化性质研究
        3.1.4 重组分支酶的底物特异性
    3.2 分支酶在淀粉改性中的应用条件研究及产物分析
        3.2.1 加酶量对分支酶在淀粉改性应用中的影响
        3.2.2 反应时间对分支酶在淀粉改性应用中的影响
        3.2.3 反应温度对分支酶在淀粉改性应用中的影响
        3.2.4 反应pH对分支酶在淀粉改性应用中的影响
        3.2.5 淀粉改性产物高效阴离子交换色谱分析
        3.2.6 淀粉改性产物高效凝胶过滤色谱分析
        3.2.7 淀粉改性产物质子核磁共振光谱学分析
    3.3 双酶复配制备改性淀粉及产物分析
        3.3.1 双酶复配制备改性淀粉研究
        3.3.2 双酶复配制备改性淀粉产物分析
    3.4 Vibrio vulnificus分支酶在B.subtilis中表达的研究
        3.4.1 Vibrio vulnificus分支酶在B.subtilis中的构建及表达
        3.4.2 不同启动子对Vibrio vulnificus分支酶表达量的影响
        3.4.3 Vibrio vulnificus分支酶在B.subtilis WS11?hrc A中的表达
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展[J]. 熊海涛,韦宇拓.  广西科学. 2018(03)
[2]淀粉改性的研究进展[J]. 孙亚东,陈启凤,吕闪闪,顾继友,谭海彦,张彦华.  材料导报. 2016(21)
[3]抗性淀粉的制备、生理功能及应用[J]. 王怡,陈祖琴,李萍,黄文丽.  食品工业科技. 2017(02)
[4]Thermomonospora curvata淀粉分支酶的过量表达及其催化反应机理研究[J]. 范琴,谢正军,金征宇,田耀旗.  现代食品科技. 2016(06)
[5]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰.  生物技术通报. 2015(02)
[6]抗消化玉米淀粉柠檬酸酯制备工艺优化[J]. 李光磊,庞玲玲,郭延成,李一卓,孙俊良.  食品工业科技. 2013(23)
[7]淀粉酯的合成、性质及应用[J]. 武文龙,辛嘉英,王艳,石佳,曲敏,夏春谷.  化学工程师. 2013(09)
[8]改性淀粉的制备方法及应用的研究进展[J]. 杨莹,黄丽婕.  食品工业科技. 2013(20)
[9]大肠杆菌内毒素对雏鸡血液指标的影响[J]. 王群辉,欧德渊,李诗举,李秀富,冯佳,李大群.  山地农业生物学报. 2009(01)
[10]物理法在淀粉改性中的研究进展[J]. 段善海,徐大庆,缪铭.  食品科学. 2007(03)

硕士论文
[1]复合酶法改性红薯淀粉制备工艺的优化及其物化特性研究[D]. 朱晨晨.安徽农业大学 2018
[2]生物酶解玉米淀粉和燕麦淀粉的消化性和回生性的研究[D]. 王玉娟.长春大学 2017
[3]木薯淀粉的化学改性及其衍生物的结构、性质和体外消化率的研究[D]. 梅既强.合肥工业大学 2016
[4]马铃薯抗性淀粉的制备工艺及活性研究[D]. 曹力心.天津科技大学 2006



本文编号：3716330