含多种人工设计功能域胶原蛋白的高效制备及应用开发
发布时间：2023-02-12 12:23
胶原蛋白作为细胞外基质中重要的结构蛋白,是人体中含量最多的蛋白质,占人体干重的30%,不仅为细胞提供了生理环境,维持生命体组织形态,还参与影响细胞粘附、增殖、迁移以及信号传导等生化活动,具有促进组织或器官的修复及再生等生物学功能。但由于动物组织提取胶原蛋白存在动物源疾病风险,限制了动物源提取胶原蛋白的应用。近年来,一种来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的的三螺旋结构类胶原蛋白引起了科学家们的兴趣,但由于这种原核来源的Scl2胶原蛋白缺乏与哺乳动物细胞结合的功能位点,在改造之前并不具有生物学功能,故本研究意在通过替换和插入的方式给Scl2重组胶原蛋白增加功能位点,并探索其在生物材料领域的应用。首先本文从分子层面上展开了对Scl2重组胶原蛋白骨架上功能位点的改造,通过PCR引物设计将不同数量的RGD(Arg-Gly-Asp)序列以定点突变的方式引入Scl2胶原蛋白骨架上。再采用同源重组的方式将天然Ⅰ型胶原蛋白与整合素的结合位点(GFPGER)取代Scl2骨架中对应的氨基酸序列,从而获得两组不同整合素位点功能化的Scl2胶原蛋白。并通过SDS-PAGE验证了各目...
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 细胞外基质
1.1.1 基膜
1.1.2 细胞基质黏附
1.2 胶原蛋白的研究进展
1.2.1 胶原蛋白的种类及结构特征
1.2.2 胶原蛋白的生物合成
1.2.3 类胶原蛋白的研究进展
1.2.4 类胶原蛋白的重组表达
1.3 重组胶原蛋白Scl2的研究进展
1.3.1 Scl2胶原蛋白的结构解析
1.3.2 Scl2胶原蛋白的工业化潜能
1.3.4 Scl2胶原蛋白骨架的功能位点改造
1.3.5 Scl2胶原蛋白融合表达小分子多肽的应用
1.3.6 Scl2胶原蛋白在组织工程应用领域的开发
1.4 整合素家族
1.4.1 整合素的结构及分类
1.4.2 整合素的激活机制
1.4.3 整合素结合配体
1.4.5 RGD在组织工程中的应用
1.4.6 RGD靶向抗肿瘤药物研究
1.5 本论文研究思路和主要内容
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 主要试剂、工具酶及试剂盒
2.1.3 培养基及缓冲液
2.1.4 实验试剂的配制
2.2 实验仪器
2.3 实验及分析方法
2.3.1 分子克隆实验
2.3.2 感受态细胞转化
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 蛋白样品脱盐
第三章 重组胶原蛋白Scl2功能位点改造
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 质粒与菌株
3.2.2 工具酶及主要试剂
3.2.3 培养基和缓冲液
3.2.4 分子生物学基本操作
3.2.5 引物设计与合成
3.2.6 RGD系列位点引入
3.2.7 GFPGER位点引入
3.2.8 重组Scl2系列胶原蛋白的表达
3.3 结果与讨论
3.3.1 RGD系列位点引入
3.3.2 GFPGER位点引入
3.3.3 Scl2系列蛋白在大肠杆菌中的表达
3.4 本章小结
第四章 SCL2系列蛋白高效纯化方法建立
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 质粒与菌株
4.2.2 工具酶及主要试剂
4.2.3 缓冲液及反应试剂
4.3 实验方法
4.3.1 Ni2+柱亲和层析
4.3.2 酸法沉降
4.3.3 木瓜蛋白酶法水解
4.3.4 胃蛋白酶水解
4.3.5 蛋白质脱盐与浓缩
4.3.6 蛋白质的保存
4.4 结果与讨论
4.4.1 Ni2+柱亲和层析
4.4.2 酸法沉降
4.4.3 蛋白酶水解
4.5 本章小结
第五章 SCL2胶原蛋白活性测试
5.1 前言
5.2 实验材料
5.2.1 细胞与黏附分子
5.2.2 实验试剂及设备
5.3 实验方法
5.3.1 蛋白浓度测定
5.3.2 细胞培养
5.3.3 细胞悬滴培养
5.3.4 黏附实验
5.4 结果与讨论
5.4.1 蛋白定量浓度测定
5.4.2 MiaPcCa-2细胞悬滴培养
5.4.3 PSC细胞悬滴分散效果
5.4.4 L929细胞黏附效果
5.4.5 HUVEC细胞黏附效果
5.5 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
本文编号：3741102
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 细胞外基质
1.1.1 基膜
1.1.2 细胞基质黏附
1.2 胶原蛋白的研究进展
1.2.1 胶原蛋白的种类及结构特征
1.2.2 胶原蛋白的生物合成
1.2.3 类胶原蛋白的研究进展
1.2.4 类胶原蛋白的重组表达
1.3 重组胶原蛋白Scl2的研究进展
1.3.1 Scl2胶原蛋白的结构解析
1.3.2 Scl2胶原蛋白的工业化潜能
1.3.4 Scl2胶原蛋白骨架的功能位点改造
1.3.5 Scl2胶原蛋白融合表达小分子多肽的应用
1.3.6 Scl2胶原蛋白在组织工程应用领域的开发
1.4 整合素家族
1.4.1 整合素的结构及分类
1.4.2 整合素的激活机制
1.4.3 整合素结合配体
1.4.5 RGD在组织工程中的应用
1.4.6 RGD靶向抗肿瘤药物研究
1.5 本论文研究思路和主要内容
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 主要试剂、工具酶及试剂盒
2.1.3 培养基及缓冲液
2.1.4 实验试剂的配制
2.2 实验仪器
2.3 实验及分析方法
2.3.1 分子克隆实验
2.3.2 感受态细胞转化
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 蛋白样品脱盐
第三章 重组胶原蛋白Scl2功能位点改造
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 质粒与菌株
3.2.2 工具酶及主要试剂
3.2.3 培养基和缓冲液
3.2.4 分子生物学基本操作
3.2.5 引物设计与合成
3.2.6 RGD系列位点引入
3.2.7 GFPGER位点引入
3.2.8 重组Scl2系列胶原蛋白的表达
3.3 结果与讨论
3.3.1 RGD系列位点引入
3.3.2 GFPGER位点引入
3.3.3 Scl2系列蛋白在大肠杆菌中的表达
3.4 本章小结
第四章 SCL2系列蛋白高效纯化方法建立
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 质粒与菌株
4.2.2 工具酶及主要试剂
4.2.3 缓冲液及反应试剂
4.3 实验方法
4.3.1 Ni2+柱亲和层析
4.3.2 酸法沉降
4.3.3 木瓜蛋白酶法水解
4.3.4 胃蛋白酶水解
4.3.5 蛋白质脱盐与浓缩
4.3.6 蛋白质的保存
4.4 结果与讨论
4.4.1 Ni2+柱亲和层析
4.4.2 酸法沉降
4.4.3 蛋白酶水解
4.5 本章小结
第五章 SCL2胶原蛋白活性测试
5.1 前言
5.2 实验材料
5.2.1 细胞与黏附分子
5.2.2 实验试剂及设备
5.3 实验方法
5.3.1 蛋白浓度测定
5.3.2 细胞培养
5.3.3 细胞悬滴培养
5.3.4 黏附实验
5.4 结果与讨论
5.4.1 蛋白定量浓度测定
5.4.2 MiaPcCa-2细胞悬滴培养
5.4.3 PSC细胞悬滴分散效果
5.4.4 L929细胞黏附效果
5.4.5 HUVEC细胞黏附效果
5.5 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
本文编号：3741102
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3741102.html
最近更新
教材专著
