代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-苹果酸的研究

发布时间：2023-10-29 11:11

　　本研究以谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为研究对象,通过代谢工程策略构建了高产L-苹果酸菌株,并结合启动子工程策略强化了磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸合成草酰乙酸的羧化途径,进一步提高了L-苹果酸产量。主要研究结果如下:(1)构建L-苹果酸生产菌株。利用质粒pK19mobsacB建立了同源重组法敲除谷氨酸棒状杆菌基因的方法,通过连续敲除磷酸乙酰基转移酶-乙酸激酶编码基因pta-ack,乳酸脱氢酶编码基因ldh,丙酮酸醌氧化还原酶编码基因pqo和苹果酸酶编码基因male,阻断了丙酮酸合成乙酸和乳酸的代谢路径以及L-苹果酸回补丙酮酸路径,成功构建了L-苹果酸生产菌株A04。菌株A04经过发酵培养后可生产L-苹果酸7.448 g/L、丙酮酸6.704 g/L。(2)强化羧化途径提高L-苹果酸产量。通过替换自身强启动子Psod来过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc和丙酮酸羧化酶编码基因pyc,强化L-苹果酸合成路径中的羧化途径,提高流向L-苹果酸的碳通量,进一步提高菌株生产L-苹果酸的能力。最终,在初步优化的发酵实验条件下,L-苹果酸最大...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 苹果酸概述
        1.1.1 苹果酸的性质
        1.1.2 苹果酸的应用
    1.2 L-苹果酸的生产方法
        1.2.1 直接提取法
        1.2.2 化学合成法
        1.2.3 酶转化或细胞转化法
        1.2.4 生物发酵法
    1.3 谷氨酸棒状杆菌研究现状
        1.3.1 谷氨酸棒状杆菌简介
        1.3.2 谷氨酸棒状杆菌研究现状
        1.3.3 谷氨酸棒状杆菌中L-苹果酸代谢路径分析
    1.4 本课题研究意义和内容
第二章 产L-苹果酸重组谷氨酸棒状杆菌的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株、质粒和引物
        2.1.2 常用仪器和试剂
        2.1.3 培养基和主要溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 谷氨酸棒状杆菌基因组的提取
        2.2.2 大肠杆菌中质粒的提取
        2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.4 琼脂糖凝胶回收方法
        2.2.5 质粒和DNA双酶切及酶切产物连接方法
        2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和热激转化方法
        2.2.7 谷氨酸棒状杆菌电转化感受态细胞的制备和电转化方法
        2.2.8 谷氨酸棒状杆菌基因敲除方法
    2.3 结果与讨论
    2.4 小结
第三章 基因敲除和过表达对谷氨酸棒状杆菌产L-苹果酸的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要仪器和试剂
        3.1.2 培养基和主要溶液配制
    3.2
        3.2.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶酶活测定
        3.2.2 各菌株菌体密度的测定
        3.2.3 发酵液中葡萄糖浓度的测定
        3.2.4 有机酸的测定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 ppc和 pyc酶活分析
        3.3.2 代谢工程改造对菌株生长情况的影响
        3.3.3 工程菌积累有机酸的分析
    3.4 小结
第四章 总结与展望
    4.1 总结
    4.2 展望
致谢
参考文献
附录1 攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3857963