Thermotoga sp.β-葡萄糖苷酶重组表达、分子改造及制备低聚龙胆糖研究

发布时间：2023-11-15 18:16

　　低聚龙胆糖是一种具有益生功能的新型功能性低聚糖,其含有的β-1,6葡萄糖苷键不易被人体消化降解,有利于双歧杆菌和乳杆菌等肠道微生物的生长。目前只有日本能够大规模生产低聚龙胆糖,我国仍处于起步阶段。一种性能良好的β-葡萄糖苷酶对于生产低聚龙胆糖至关重要。本研究在枯草芽孢杆菌中成功重组表达β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A,对其表达的β-葡萄糖苷酶TsBgl1A生产低聚龙胆糖的条件进行了优化。之后通过定点突变获得三个转化率提高的突变体,结合突变位点的三维空间位置从转苷/水解比、动力学参数等方面分析了突变体转化率提高的原因,最后对最优突变体G224A进行了摇瓶优化和3-L罐发酵条件的初步摸索。主要研究结果如下:(1)热袍菌Thermotoga sp.KOL6来源的β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A成功在B.subtilis WS11中重组表达。进一步对重组酶的酶学性质进行探究,测得其最适温度和最适pH分别为90℃和6.0,重组酶具有良好的温度稳定性和pH稳定性;重组酶对四种二糖底物和pNPG具有良好的水解活力。(2)分别探究了不同条件对重组酶制备低聚龙胆糖的影响,确定最优酶转化条件:反应温度80...

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 β-葡萄糖苷酶简介
        1.1.1 β-葡萄糖苷酶的来源及催化机制
        1.1.2 β-葡萄糖苷酶的结构
        1.1.3 β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性
    1.2 低聚龙胆糖简述
        1.2.1 低聚龙胆糖的理化性质
        1.2.2 低聚龙胆糖的制备方法及研究现状
        1.2.3 低聚龙胆糖的应用前景
    1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
    1.4 立题依据及意义
    1.5 本论文的研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 培养条件
        2.2.1 培养基
        2.2.2 培养条件
    2.3 基因工程操作方法
        2.3.1 引物设计
        2.3.2 核酸胶电泳验证和回收
        2.3.3 枯草芽孢杆菌表达载体的构建
        2.3.4 突变质粒构建
        2.3.5 大肠杆菌JM109菌株感受态的制备及转化
        2.3.6 枯草芽孢杆菌感受态制备及转化
    2.4 分析方法
        2.4.1 菌体浓度的测定
        2.4.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
        2.4.3 β-葡萄糖苷酶酶活测定
        2.4.4 葡萄糖浓度测定
        2.4.5 蛋白浓度测定
        2.4.6 纯化方法
        2.4.7 转苷/水解测定
        2.4.9 低聚龙胆糖的酶转化工艺及检测
        2.4.10 分子模拟
第三章 结果与讨论
    3.1 β-葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及酶学性质研究
        3.1.1 重组菌B.subtilis/p BSMμL3-Tsbgl1A的构建
        3.1.2 重组酶Ts Bgl1A的表达与纯化
        3.1.3 重组酶Ts Bgl1A的酶学性质
    3.2 β-葡萄糖苷酶制备低聚龙胆糖的条件优化
        3.2.1 反应时间对制备低聚龙胆糖的影响
        3.2.2 加酶量对制备低聚龙胆糖的影响
        3.2.3 温度对制备低聚龙胆糖的影响
        3.2.4 pH对制备低聚龙胆糖的影响
        3.2.5 葡萄糖浓度对低聚龙胆糖转化率的影响
    3.3 β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性分子改造
        3.3.1 突变体的设计及构建
        3.3.2 突变体制备低聚龙胆糖转化率
        3.3.3 突变体对重组酶Ts Bgl1A转苷活性影响的机制分析
    3.4 重组菌B.subtilis/p BSMμL3-Ts Bgl1A-G224A的发酵条件优化
        3.4.1 重组菌的摇瓶发酵优化
        3.4.2 重组菌的3-L罐发酵
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3864251