载microRNA-140金纳米粒的制备及其与氯诺昔康联合治疗骨关节炎的研究

发布时间：2023-11-18 10:49

　　骨关节炎是一种关节软骨的退行性疾病。诸多因素均可引起关节软骨变性和丢失,继而导致关节边缘和软骨下骨骨质再生并引发滑膜炎症。骨关节炎是常见的致残疾病,发病率高,严重威胁着人类的健康和生活。尚无有效的方式治疗骨关节炎,临床上主要通过药物治疗(口服或关节腔注射)来缓解骨关节炎的症状,但并不能从根本上修复骨关节炎的软骨损伤。目前,骨关节炎的基因治疗受到了广泛关注,其可以通过调节相关基因的表达而促进软骨修复。此外,与单一疗法相比,联合治疗的方式可以起到增强疗效的作用。因此,将基因和药物联合应用来治疗骨关节炎可为骨关节炎的治疗提供新思路。氯诺昔康是一种新型的非甾体类抗炎药,主要通过发挥抗炎镇痛作用来治疗骨关节炎。MicroRNA-140是一种小的非编码RNA,可以通过调节与骨关节炎相关基因的表达,从而促进软骨修复。将氯诺昔康和microRNA-140联合应用可达到消除炎症和修复软骨损伤的双重目的。但microRNA难入胞且容易被核酸酶降解,仍需寻求合适的microRNA递送载体来克服microRNA应用的瓶颈。金纳米粒是直径为1～100nm的金的缔合胶体,具有很多优良的性质,是常用的基因递送载体。...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
符号说明
前言
第1章 AuNPs/miR-140复合物的制备及表征
    1. 实验材料
        1.1 试药
        1.2 仪器
    2. 实验方法
        2.1 主要溶液的配制
            2.1.1 氯金酸溶液
            2.1.2 PEI溶液
            2.1.3 10×TAE电泳缓冲液
            2.1.4 MiR-140浓储液
        2.2 AuNPs的制备
            2.2.1 AuNPs的初步制备方法
            2.2.2 PEI体积对AuNPs制备的影响
            2.2.3 反应温度对AuNPs制备的影响
            2.2.4 反应时间对AuNPs制备的影响
        2.3 AuNPs的表征
            2.3.1 外观性状及微观形态
            2.3.2 粒径及电位分布
        2.4 AuNPs/miR-140复合物的制备
            2.4.1 复合物的制备
            2.4.2 复合物最佳质量比(W/W=Au/miR-140)的筛选
                2.4.2.1 琼脂糖凝胶阻滞电泳
                2.4.2.2 粒径及电位分布
        2.5 金纳米粒/miR-140复合物的稳定性实验
            2.5.1 肝素提取实验
            2.5.2 复合物在RNA酶A中的稳定性实验
    3. 实验结果与分析
        3.1 AuNPs的制备
            3.1.1 PEI体积对AuNPs制备的影响
            3.1.2 反应温度对AuNPs制备的影响
            3.1.3 反应时间对AuNPs制备的影响
        3.2 AuNPs的表征
            3.2.1 AuNPs的外观性状及微观形态
            3.2.2 AuNPs的粒径及电位分布
        3.3 AuNPs/miR-140复合物的最佳质量比的筛选
            3.3.1 AuNPs/miR-140复合物的琼脂糖凝胶阻滞电泳
            3.3.2 不同质量比的AuNPs/miR-140复合物的粒径及电位分布
        3.4 稳定性实验结果
            3.4.1 肝素提取实验结果
            3.4.2 复合物在RNA酶A中的稳定性实验结果
    4. 讨论
    5. 结论
第2章 AuNPs /miR-140复合物的体外评价
    1. 实验材料
        1.1 试药
        1.2 仪器
        1.3 细胞
    2. 实验方法
        2.1 主要溶液的配制
            2.1.1 MTT溶液
            2.1.2 细胞实验用磷酸盐缓冲液(PBS)
        2.2 细胞毒性实验
        2.3 细胞转染实验
            2.3.1 荧光显微镜观察
            2.3.2 流式细胞仪测定
        2.4 qPCR测定miR-140以及COL2A mRNA的相对表达
            2.4.1 总RNA的提取步骤
            2.4.2 MiR-140的逆转录步骤
            2.4.3 总RNA的逆转录步骤
            2.4.4 实时荧光定量PCR反应步骤
        2.5 统计分析
    3. 结果与分析
        3.1 细胞毒性实验结果
        3.2 细胞转染实验结果
            3.2.1 荧光显微镜观察结果
            3.2.2 流式细胞仪检测结果
        3.3 qPCR测定miR-140和COL2A mRNA的表达
            3.3.1 qPCR测定miR-140的表达
            3.3.2 qPCR测定COL2A mRNA的表达
    4. 讨论
    5. 结论
第3章 Lnxc和miR-140联合治疗OA的药效学研究
    1. 实验材料
        1.1 试药
        1.2 仪器
        1.3 动物
    2. 实验方法
        2.1 主要溶液的配制
            2.1.1 1%木瓜蛋白酶和0.03M的半胱氨酸混合溶液
            2.1.2 Lnxc-sol
        2.2 大鼠膝关节OA模型的建立
        2.3 实验方案设计
            2.3.1 分组
            2.3.2 给药方案
        2.4 药效学评价指标的观察与测定
            2.4.1 软骨的外观观察
            2.4.2 软骨和滑膜的组织学评价
                2.4.2.1 股骨踝、胫骨平台和滑膜等组织的处理
                2.4.2.2 HE染色
                2.4.2.3 番红O-固绿染色
                2.4.2.4 软骨和滑膜的组织病理学评分
        2.5 统计分析
    3. 结果与分析
        3.1 大鼠体重和膝宽的测定结果
        3.2 大鼠股骨踝和胫骨平台外观观察结果
        3.3 软骨和滑膜的组织学评价结果
            3.3.1 股骨踝和胫骨平台切片的HE染色结果
            3.3.2 滑膜切片的HE染色结果
            3.3.3 股骨踝和胫骨平台切片的番红O-固绿染色结果
        3.4 软骨和滑膜的组织病理学评分
            3.4.1 股骨踝和胫骨平台的Mankin评分
            3.4.2 滑膜的组织病理学评分
    4. 讨论
    5. 结论
总结与展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表文章
学位论文评阅及答辩情况表



本文编号：3865137