异源表达L-氨基酸脱氨酶全细胞催化L-丙氨酸合成丙酮酸

发布时间：2024-05-11 06:10

　　丙酮酸(Pyruvic acid)是药物合成领域的重要中间体,广泛应用于制药和化学工业。目前工业上合成丙酮酸的方法主要包括微生物直接发酵法和化学合成法。其中,化学合成法对于环境污染较大,且成本较高;而微生物直接发酵法中,底物对丙酮酸的转化率不高,产物成分复杂且分离困难。通过生物催化法合成丙酮酸可以克服上述两种方法的不足和缺点,因此,在工业化应用中具有广阔前景。本研究利用表达源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶(pm1)的E.coli重组菌来催化合成丙酮酸,并从表达pm1伴侣蛋白(细胞色素b562,cyb C)、分子改造pm1以及摇瓶和罐上条件优化等方面提高全细胞催化合成丙酮酸的效率。论文主要内容如下:(1)在E.coli BL21(DE3)中异源表达pm1,并对发酵条件和催化条件进行优化,确定适宜的发酵和催化条件。其中,诱导温度为25℃,诱导时间为14 h,诱导剂IPTG浓度为0.04 mM;催化过程中细胞浓度为1.5 g·L^-1,底物浓度为80 g·L^-1的D,L-丙氨酸,反应液pH值为7.0,最终丙酮酸产量达到17.4...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-1酒石酸法合成丙酮酸Fig.1-1Synthesisofpyruvatebytartaricacid

图1-1酒石酸法合成丙酮酸Fig.1-1Synthesisofpyruvatebytartaricacid丙酮与空气在45℃时混合95min，再通过氢氧酮酸。该方法需要在化学催化剂(如Pd和Pb行，对于设备条件的要求比较低。然而，由于以用于大规模的丙酮酸制....

图2-1饱和突变及高通量筛选流程

图2-1饱和突变及高通量筛选流程Fig.2-1Saturationmutationsandhigh-throughputprocesses提取和酶学性质测量mMpH7.0磷酸钠盐缓冲液悬浮对照菌和突变菌细胞，通过超声过10,000rpm离心1h使未....

图3-1L-氨基酸催化丙氨酸生成丙酮酸Fig.3-1PyruvateproducedbyL-aminoaciddeaminasefromalanine

第三章结果与讨论第三章结果与讨论生产菌株的构建文献报道，来源于Proteusmirabilis的L-氨基酸脱氨酶有pm1，pma，其中pm1能高效催化L-丙氨酸合成丙酮酸(图3-1)。因此，我们将(DE3)中进行异源表达，构建可以产pm1的E.co....

图3-2SDS-PAGE分析蛋白表达情况

L-氨基酸催化丙氨酸生成丙酮ducedbyL-aminoaciddeami因序列设计引物，之后以eI和XhoI)酶切和纯化回至感受态细胞中，通过菌验证。为确定pm1在E.进行全细胞电泳分析，如近，说明已成功将pm1因是外源膜蛋白的表达在E.coli....

本文编号：3969639