沼气池中产甲烷菌的分离鉴定及其分布的研究

发布时间：2020-06-04 16:22

【摘要】： 在沼气发酵过程中，甲烷的形成是由一群生理上高度专业化的古细菌——产甲烷菌所引起。产甲烷菌生长在严格厌氧的环境中，它们不能利用复杂的有机物作为能量来源，只能利用氢气、二氧化碳、甲酸、甲醇、甲基胺、乙酸等简单物质合成甲烷进行能量代谢，是厌氧发酵过程的最后一个成员。甲烷的生物合成是沼气发酵过程的关键步骤，分离鉴定越冬沼气池中占优势的产甲烷菌及研究产甲烷菌的类群分布，将有利于更好的了解北方冬季条件下产甲烷菌群的活动，为进一步提高沼气发酵的效率提供依据。通过改进的亨盖特(Hungate)厌氧技术，从越冬猪粪发酵沼气池中分离到两株产甲烷菌菌株SH01和SH02。菌株SH01呈弯曲杆状，革兰氏阴性，有运动性，形成淡黄色菌落，能利用二氧化碳和甲酸钠作为碳源，但不能利用甲醇、乙酸钠和三甲胺。该菌最适生长pH为6.8-7.2，最适生长温度为35-40℃，最适Na~+浓度低于0.1mol／L。通过生理、形态结构特征与16S rDNA序列的同源性分析，表明菌株SH01是甲烷螺菌属中的一个成员，为亨氏甲烷螺菌(Methanospirllum hungatei)。菌株SH02呈球状，革兰氏阴性，无运动性，形成淡黄色菌落，能利用二氧化碳和甲酸钠作为碳源，但不能利用甲醇、乙酸钠和三甲胺。该菌最适生长pH为7.5-8.0，最适生长温度为32-37℃，最适Na~+浓度低于0.3mol／L。通过生理、形态结构特征与16S rDNA序列的同源性分析，表明菌株SH02是甲烷袋形菌属(Methanoculleus)中的一个成员。应用MPN法(最大或然估计法)研究在不同节气下产甲烷菌类群的变化，通过估计在不同节气中利用不同底物产甲烷菌所占的比例，来考查沼气发酵的效率与产甲烷菌族群的关系。实验结果表明，在不同节气下乙酸营养型(以乙酸或乙酸盐为底物)的产甲烷菌在产甲烷菌族群中占有优势，约占60-80％；不同节气下产甲烷菌数量差别较大，，12月份产甲烷菌的数量最低，约为10×10~6，6月份产甲烷菌的数量最高，约为10×10~8，与沼气中甲烷含量与产气量的变化相一致。
【图文】：

古生菌,系统发育树,产甲烷菌

由16SrRNA碱基序列的相似性确定了产甲烷菌为一同源性较高的菌群，从而提出了一个比较完整的分类系统。这一系统依据13种17个菌株的分析将产甲烷菌分为3目，4科，7属，13种。图1.2为依据16SrRNA碱基序列构建的古生菌系统发育树，从发育树中可以看出在整个古菌域中产甲烷菌的种属最多，在分类学中占有重要地位。 1988年，由Boone提议并在系统细菌学国际委员会产甲烷菌分类学分会的会议上讨论确定了描述产甲烷菌新种的最低标准特征[3v]，除了包括细胞和菌落形态、培养特征、代谢和合成机制、最适生长温度和pH、最适盐浓度及G十Cmol%等以外，还推荐应用DNA/DNA杂交、RNA序列分析、蛋白指纹和电子显微镜技术。在钊白杰氏系统细菌学手册》 (1989)第一版第三卷中，产甲烷菌己列有3目，6科

甲烷气,质谱图

10天后，经过气相色谱检测可以发现有甲烷气产生。由于气相色谱是通过保留时间定性的，所以第一次检测选用岛津气相色谱质谱联用仪GCMS一QP2010进行定性分析，图2.1为纯甲烷气(99.995%)的质谱谱图，图2.2为富集培养试管中气相成份的谱图。从图2.1和图2.2可以看出，富集培养的试管气相中含有甲烷气，而且含有大量的氮气和二氧化碳，可能是由于接种操作是在厌氧操作箱中进行的，厌氧箱中是混合气(85%NZ，10%HZ，5%COZ)，所以在把试管中气相置换成80:20的HZ/CO:后仍有N:气的残留而且不被消耗。图2.1纯甲烷气的质谱图 Fig.2.lGC一 MSofMethane，c.“奋:洲已
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S216.4

【参考文献】