农村户用沼气池发酵微生物群落结构的分子解析

发布时间：2020-08-25 07:24

【摘要】： 随着人类社会的发展，能源短缺、环境污染问题日益突出，已严重威胁人类的生存和发展。沼气技术是解决我国农村能源危机和环境污染，实现农业可持续发展的有效途径。由于传统研究手段的限制，目前对沼气发酵微生物群落结构缺乏全面、准确的了解，从而阻碍了工程和工艺的改进进程，致使农村系统运行效率低和可控性差的问题难以解决。现代分子生态学技术在环境微生物研究中的成功应用，为突破这一技术瓶颈提供了新思路。本论文运用基于16S rDNA的克隆文库分析和DGGE指纹图谱分析等分子生态学技术，对农村户用沼气池发酵微生物的群落结构进行了解析。 首先通过对前人活性污泥的提取方法改进，建立了农村户用沼气池厌氧活性污泥总DNA的有效提取和纯化方法，DNA的得率、完整性、质量均可满足分子生态学研究的需要。 通过对PCR-DGGE条件的优化，建立了农村户用沼气池厌氧活性污泥微生物16S rDNA V3区PCR-DGGE分析体系：25μ1 PCR反应体系中，模板量为1ng；采用Touchdown PCR方式；DGGE胶变性剂浓度范围35％～56％；上样量为600ng，150V电泳270min，可较为准确地反映农村户用沼气池厌氧活性污泥微生物的多样性和群落组成。 分别构建了农村户用沼气池细菌和古菌的16S rDNA文库，通过文库分析，对农村户用沼气池发酵微生物的多样性进行了探索。结果表明，农村户用沼气池发酵系统微生物种类非常丰富，细菌比古菌表现出更为复杂的微生物多样性。不同微生物种群的丰度存在明显差异，有少数明显优势种群。其中的细菌，包括72个种群，大多数属于未培养菌，主要分属于五大类：低G+C革兰氏阳性菌(Firmicutes)、变形细菌(Protecobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、绿屈挠菌(Chloroflexi)和Genera-incertae-sedis-OP11。其中以低G+C革兰氏阳性菌为主，包含其2个亚类：梭菌(Clostridia)和芽孢杆菌(Bacilli)，占库容的54％，其次为拟杆菌占库容36％；其中的古菌，包括9个种群，都属于广古菌(Euryarchaeota)，包括甲烷鬃菌(Methanosaeta)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和甲烷盘菌(Methanoplanus)、甲烷囊菌(Methanoculleus)等，一分类地位不明确的Uncultured euryarchaeote和Methanocorpusculum parvum为优势种群。 利用PCR-DGGE指纹图谱分析技术对农村户用沼气池中正常池和酸化池的细菌和古菌微生物群落结构分别进行了比较，并进行动态跟踪监测。结果显示：两种沼气池中微生物种类都非常丰富，细菌比古菌表现出更为复杂的微生物多样性。不同微生物种群的丰度存在明显差异，有少数明显优势种群，这与16S rDNA克隆文库分析结论基本一致。正常池与酸化池的细菌群落结构存在明显差异，酸化池中梭菌(Clostridia)比重高，而拟杆菌(Bacteroidetes)相对较少；而两种池中古菌的群落结构非常相似。由此初步推断，影响农村户用沼气池发酵状况的可能主要是细菌，而不是古菌；不同时期，正常池和酸化池中细菌和古菌的多样性都基本稳定，但部分种群的丰度随着温度的变化有所改变，拟杆菌(Bacteroidetes)丰度的随发酵温度升高增加，而梭菌(Clostridial则相反。 本论文初步解析了农村户用沼气池发酵微生物的群落结构，为进一步优化群落结构、调节群落功能提供了科学依据，为实现我国农村沼气发酵的高效、可控运行奠定了基础。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S216.4;S182
【图文】：

图1一2稳定性同位素探测技术的技术路线示意图sIP技术可以应用于厌氧环境中互营微生物的研究。o印han等(2001)通过该技在冰冷的缺氧沉积物中检测到极低的’3c:甲烷自然丰度(同其它含碳化合物相)，这表明这些沉积物中存在一组与Methanosarcinales相关的可氧化甲烷的古菌，

2.1实验材料2.1.1厌氧活性污泥样品来源活性污泥样品采集于北京郊区某能源生态技术示范基地(图2一1)沼气池，基地采用的是以沼气为纽带，目前在中国农村大力推广的“猪一沼一果”生态家园模式。沼气池建在果树塑料大棚中猪圈的下面，沼气发酵原料为猪粪。采集厌氧活性污泥样品4℃厌氧保存，12小时内对样品进行处理。图2一1北京郊区某能源生态技术示范基地2.1.2菌株菌株 EscherichiacoliDH5a为中国农业科学院生物技术所保存。2.1.3培养基液体 LBTryptone10.09， Yeastextract5.09， NaCI10.09，定容至IL

本论文的厌氧污泥样品采集于北京郊区某能源生态技术示范基地沼气池。基地在开展本研究之前已运行两年，基地采用的是目前在我国农村大力推广的“猪一沼一果”生态模式(图3一l)。沼气池建于果树塑料大棚中猪圈的下面，猪粪作为沼气发酵的原料，经厌氧发酵产生沼气、二氧化碳和沼肥。沼气发酵使农村重要污染源一畜禽粪便得以充分利用，所产生的沼气还可以用作生活燃料，二氧化碳可促进果树的光合作用，同时沼肥是优质的有机肥。沼气池是该模式的核心，它联结着养殖和种植，起到了生产和生活的枢纽作用。2006年初，本研究对该村80多户农村户用沼气池的运行状况(发酵液的酸碱度和产气量状况等)进行了初步调查分析。调查结果(表3一l)显示:发酵液pH为7.0一7.5、发酵状况正常、产气量较高的沼气池占42%;pH低于6.7、产气量低的酸化池占58%。比较发现，发酵状况正常的沼气池液面泡沫较碎、厚、而小(图3一2)

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本文编号：2803431