微藻-酵母混合培养强化沼液生物转化及其分子机制研究

发布时间：2020-10-21 02:49

　　 我国是沼气生产大国,沼液的处理及利用一直是制约沼气工业发展的瓶颈。沼液深度资源化利用被认为是沼液变废为宝、实现循环经济的必由之路。微藻能高效同化沼液中的氮、磷,在实现沼液净化的同时可联产微藻生物质。该过程可降低沼液处理成本,微藻生物质又可作为生物能源、饲料、肥料等的原料。微藻与酵母混合培养由于存在种间协同效应,使其在污染物去除和微生物生物质生产方面具有明显的优势。本文系统比较了微藻、酵母单培养和混合培养对沼液污染物去除及生物质生产效果的差异;通过转录组分析阐明了微藻-酵母强化污染物生物转化的内在分子机制。主要的研究结果如下:(1)微藻、酵母单培养及混合培养利用酵母工业沼液的研究表明,酵母工业沼液可以作为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)培养的低值底物,且和普通小球藻(Chlorella vulgaris)的混合培养可以强化微生物生物质的产出;混合培养中的NH_3-N的去除效果优于单培养且随着稀释倍数的增加而增加;混合培养组间的NH_3-N去除和微藻起始接种密度正相关;混合培养获得了更高的油脂及高位热值产量。(2)微藻、酵母单培养和混合培养利用牛场沼液的研究表明,混合培养可以强化微生物生物质产出;混合培养从培养环境中固定了更多的C、N,且获得更高的油脂、蛋白及高位热值产量;混合培养的总磷去除效率(48小时达到100%)优于单培养;在NH_3-N充足时,混合培养体系中普通小球藻(C.vulgaris)的氮同化关键基因硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶II(GSⅡ)的转录水平均低于低于微藻单培养体系;微藻单培养中NH_3-N的耗尽,使得微藻启动NO_3~-同化进程,伴随着NR转录水平的急剧升高。(3)在模拟废水中进行的微藻、酵母单培养和混合培养的研究表明,混合培养中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)细胞的比生长速率(0.30 d~(-1)和0.99 d~(-1))显著高于相应的单培养;酵母细胞体积明显减小,而微藻相对叶绿素含量显著增加;可获得更高的碳、氮同化效率,并使得生物固定的碳主要流向碳水化合物;获得了较高的油脂(0.77 g/L)、碳水化合物(1.82 g/L)、蛋白质(1.99 g/L)和高位热值产量(114.64 kJ/L)。(4)解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)响应蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)混合培养过程中(24小时)全局代谢调控的研究表明,有167个差异表达基因受混合培养与否的影响,其中100个显著上调,67个显著下调;GO富集分析显示DEGs的功能极显著富集于69个terms;其中,DEGs最为集中的18个GO terms分析表明,混合培养对酵母细胞中与好氧呼吸、核糖体相关的基因的表达产生影响,且主要为下调基调,表明混合培养中的好氧呼吸作用和蛋白质合成能力可能受到抑制;全局代谢网络及KEGG富集分析表明混合培养对解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)细胞内主要代谢通路影响不明显,仅有11个显著差异表达基因被显著富集到核糖体(Ribosome)和叶酸一碳库(One carbon pool by folate)通路,表明混合培养仅对上述代谢通路影响产生了显著的影响,且富集到叶酸一碳库代谢通路上的DEGs均为下调。(5)蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)响应解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)混合培养的全局代谢调控的研究表明,有5731个unigenes的表达发生显著变化,其中显著上调的有3593个,显著下调的有2138个;有3174个显著差异的unigenes显著地富集于251个terms、极显著地富集于113个terms;极显著富集的terms中除了光合作用调节-光反应、蛋白修复以及叶绿体基质类囊体中所涉及的差异表达unigenes为下调外,其余的GO terms中的上调基因数目基本上均明显多于下调基因数目;全局代谢网络及KEGG富集分析表明混合培养对C.pyrenoidosa细胞内代谢的影响产生了显著影响,差异表达unigenes显著富集于一系列中心代谢通路,包括碳代谢、氮代谢、色氨酸代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、柠檬酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径等;混合培养体系中光合系统的光反应被抑制,引起了暗反应阶段CO_2固定能力的减弱;碳代谢分析表明虽然混合培养体系的CO_2固定相关路径被抑制,TCA循环、糖酵解/糖异生和磷酸戊糖途径的过程均得到强化;氮代谢通路分析表明混合培养体系中硝酸盐同化过程所涉及的关键酶基因的表达均得到上调。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S216.4
【部分图文】：

华南理工大学博士学位论文沼液产生过程及沼液的性质我国工、农业快速发展，产生的大量废水给周边生态环境造成了2004 年开始在全国推广沼气工程。以厌氧发酵为主要技术单元的物可降解有机物浓度的同时，可以产生清洁能源—沼气，具有环用的双重效果。厌氧消化（Anaerobic digestion，AD）是一种四其反应机理见图 1-1，具体包括水解阶段、酸化阶段、产氢产乙个阶段。通过复杂的微生物群落可以降解包括动物粪便、农业剩废弃物以及食品废弃物等原料中的有机物，产生沼气和厌氧消化

华南理工大学博士学位论文内目前应用较多的脱碳的工艺有吸收变压吸附、高压水洗、物理化学吸收法、膜分离法等[16]，脱出的碳又可以作为微藻光合自养生长的碳源。因此，微藻培养和沼气工程中沼液处理和沼气提质有很好的耦合度[12]（图 1-2），即微藻除可以利用沼液中的氮磷、有机物等外，沼气提质过程分离出的 CO2还可以作为微藻光合作用的碳源生产有价值的微藻生物质，因此可减少外部营养源的投入，可获得高附加值的生物质产品，如动物饲料、高级有机肥和生物柴油等。加上微藻生长速度快，生长周期短，对沼液的净化速率高，利用微藻净化沼液已经引起广泛的关注。

共有6条染色体，基因组全长为20.5 Mb，G+C含量为49%，其明晰的遗传背景为后续通过分子生物学手段开展深入的机理研究提供了保障。图1-2 酵母生产油脂涉及的工农业低成本底物概况Figure 1-2 Overview of low-cost substrates from agriculture and industry for lipid productionby yeast1.5.1 粗甘油生物柴油（长链脂肪酸甲酯）是以动植物油脂为原料制备的燃料。其制备方法中酯交换法由于工艺简单、操作费用低、制得的产品性质稳定等优点，在工业应用中最为广泛。动植物油脂中主要含有三酰甘油酯，在催化剂的作用下，能和短链醇（主要有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等，其中甲醇用的最多）反应生成脂肪酸酯和副产物甘油，典型的反应反应如式1-2。（式1-2）粗甘油（Crude glycerol）是生物柴油生产的主要副产物，通常含有80%的甘油、10%的水、7%的灰分及少于1%的甲醇[69]。每生产10千克生物柴油会产生1千克粗甘油。而此类粗甘油的提纯过程繁琐的、昂贵（0.20美元/磅）[70]。粗甘油是一种放错地方的资源，
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本文编号：2849525