沼液中萜类化合物新型结构的发现与生物活性的研究

发布时间：2020-11-09 00:25

　　 沼液是产沼气发酵的副产物，在农业生产中享有“生物肥料”和“生物农药”之称，并被广泛推广和应用。但随着我国沼气工程的迅速发展，沼液也同时得到大量生产，因此沼液的资源化、无害化利用技术的研究具有重要意义，是实现沼液高值化利用的有效途径。目前，关于沼液和沼渣的有机质成分报道很少，且在沼液中被鉴定的化合物主要是植物激素、游离氨基酸、Vitamin B、抗生素、2-喹啉酮及17-雌二醇，他们表现出促进作物生长发育，抗微生物等活性。因此，本研究目的为：一是从鸡场沼液中分离获得多个化合物，了解鸡场沼液化学成分；二是在鸡场沼液化合物中筛选具有抗菌活性或他活性的成分，以明确沼液抑菌成分和获得药物先导成分；同时，积累大量沼液化学物质的波谱数据，为沼液的高值化研究提供依据。本文以正常运转的上海市浦东新区六灶镇文彬养鸡场沼气池的沼液为研究对象，分离鉴定其化学成分，并对化合物的活性做出评价。本文采用萃取、重结晶和柱层析法（正相硅胶柱层析、Sepadex LH-20及高效液相色谱等）对鸡场沼液进行分离纯化，并运用波谱学技术(EI-MS，HR-ESI-MS，1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY、X-Ray Single Crystal Diffraction)鉴定化合物的结构。本研究共分离纯化得到14个化合物，结合文献对照，鉴定了其中8个成分的化学结构，分别为24-Norolean-12-ene-3,22-dione (化合物1)、24-Norolean-4,12-diene-3,22-dione (化合物2)、3-Hydroxy-24-Norolean-12-diene-22-one (化合物3)、3-Hydroxy-24-Norolean-12-ene-22-one (化合物4)、S-equol(化合物5)、8-羟基-3,4-二氢喹啉-2-酮(化合物6)、(E)-3-(2-羟基苯)丙烯酰胺(化合物7)、苯乙酸(化合物8)；其中，化合物1～4是新化合物，化合物5、6、7、8是首次从鸡场沼液中被报道，其他化合物结构仍在鉴定中。 对化合物1～5进行抑菌活性试验，发现S-equol(化合物5)对铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李氏特氏菌六种供试菌株均表现出抑制活性，且对蜡样芽孢杆菌、金黄葡萄球菌和单增李斯特氏菌的抑制活性要高于对铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌的抑制活性。其中，S-equol对蜡样芽孢杆菌具有很好的抑制活性（MIC为48μg/ml），与苯唑青霉素对蜡样芽孢杆菌的抑制能力相近（MIC为32μg/ml)，推断其可能具有防腐方面的应用；而新化合物1～4对六种供试菌株均没有抑制活性。体外Hela细胞毒性实验表明，化合物1对Hela细胞基本没有毒性。从鸡场沼液分离到的4个新化合物都属于五环三萜类，初步推断这些新五环三萜化合物由大豆甾醇B转化而成，含大豆饲料经鸡摄入肠道并代谢排出体外，而大豆甾醇B有可能已在鸡肠道被部分氧化，进而被加进沼气发酵池进行厌氧发酵继续被氧化，形成新化合物。前人研究指出，化合物5(S-equol)和化合物7（o-coumaric acid amide）均具有很强的抗氧化性。此外，S-equol还被证实具有具有多种生物活性，如抗乳腺癌、前列腺癌作用。因此，进一步研究鸡肠道和沼液发酵池菌群与上述高活性化合物的关系，并研究这些菌株产业化的可能性就显得很有必要。从鸡场沼液中分离到具有抑菌活性的化合物为：S-equol、8-羟基-3,4-二氢喹啉-2-酮、(E)-3-(2-羟基苯)丙烯酰胺和苯乙酸,很好的解释了沼液的抑菌作用。 由此可见，以鸡场沼液为对象开展系统的新结构化合物的研究，明确沼液抑菌成分和发现药用先导化合物，以及积累更多化合物的波谱数据，将丰富沼液研究的系统性。这对实现沼液高值化利用具有重要的意义，也将产生一定的经济效益。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：S216.4
【部分图文】：

按 1：2 进行萃取。先用石油醚进行萃取 6 次，合并浓缩后得石油次用乙酸乙酯进行萃取 6 次，合并浓缩后得到乙酸乙酯萃取物 84g进行萃取 6 次，收集、浓缩得到正丁醇萃取物 57g；由于余下水相是极性很大的糖类、蛋白等，故舍弃。（流程图见 2-1）

(a)石油醚和乙酸乙酯部分分离流程图

F-(PE+EA)III-C3（2.65g）经葡聚糖 LH-20 柱层析，以甲醇/氯仿（7:3）洗脱，根据 TLC 检测结果收集合并、浓缩以 10%浓硫酸乙醇溶液染色为洗脱液，再经半制备 HPLC 纯化，以 85%甲醇/水溶剂等度洗脱，流速 10ml时间 tR=32.99 min 和 tR=19.81 min 出峰的组分（见图 2-4），分别得到化合合物 4。
【参考文献】

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本文编号：2875587