产纤维素酶菌株筛选优化及对秸秆厌氧发酵的促进机制
发布时间：2021-11-23 22:22
秸秆是数量最多且最难处理的一类农业废弃物,将秸秆厌氧发酵转化为沼气、沼液和沼渣,可得到气液固三态的产品,是实现农业可持续发展的有效举措。然而,木质纤维素成分分解转化困难,成为秸秆沼气转化的瓶颈。因此,研究秸秆的高效预处理工艺,对促进木质纤维素分解,提高厌氧发酵产沼气效率有重要意义。本研究针对秸秆的生物预处理,部分结合化学预处理,研究了高产纤维素酶菌株及其酶对秸秆预处理的厌氧消化效果,探索农业纤维素废弃物沼气转化的预处理模式,优化预处理剂的添加方式（菌或酶）、添加量、添加时间等工艺,并通过VFA、碱度、产气量、甲烷含量、微生物菌群等指标来探究预处理在秸秆沼气转化中的作用机制。主要结果如下:（1）经过定向筛选和鉴定,获得三株高产纤维素酶的真菌,分别为Trichoderma harzianum（哈茨木霉:L）、Trichorderma viride（黄绿木霉:LT）和Aspergillussp.（黑曲霉:HE）。优化产酶条件可得,在产酶培养基固液比为1:2,温度分别为25 ℃、25 ℃和30 ℃,pH值为3.5的条件下,产酶培养3d,三菌株产粗酶液中纤维素酶的活性最高。（2）为探索真菌对秸秆...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图I-2木质纤维素结构示意图:纤维素、半纤维素和木质紊(Zahidetal,2014)
日产甲烷量??据日产沼气量和甲烷含量计算日产甲烷量。使用公式（２－３）计算（赵肖玲等，２０１８）：??＾ｍｅｔｈａｎｅ＝?＾ｂｉｏｇａｓｘ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ?ａｄｄｅｄ?公式（２－３中Ｆｍｅｔｈａｎｅ为日产甲院体积，ｍＬ／ｇ：?Ｆｂｉ〇ｇａｓ为日产沼气体积，ｍＬ；?＼（／ＣＨ４为日产沼气中甲焼；?７５ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓａｃｉｄｅｄ为添加原料的总干物质质量，ｇ。??生物分析??真菌鉴定??菌基因组ＤＮＡ使用Ｅｚｕｐ柱式真菌基因组ＤＮＡ抽提试剂盒（ＳＫ８２５９）标准抽提步骤提取菌通用引物ＩＴＳ１／ＩＴＳ４：扩增序列，ＰＣＲ反应后１％琼脂糖凝胶电泳，１５０Ｖ、１００ｍＡ电泳２０ｍ之后纯化回收，克隆测序（由上海生工股份有限公司完成），并提交ＧｅｎＢａｎｋ注册。??发酵液总细菌ＤＮＡ提取??细菌ＤＮＡ基于改进的方法提取（ＹｕａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎａｒｋ，２００４；于佳动，２０１７）?〇??
向２ｍＬ灭菌离心管中加入０．９ｍＬ０．９％的生理盐水，尽可能多的接种菌种，加入０．６ｍＬ８０油，混匀置于－３０?°Ｃ冰箱中长期保存。??３．１．２．３真菌的形态学观察??１）菌落观察：用玉米秸秆粉固体培养基３０?°Ｃ培养５ｄ，观察菌落表面状态、颜色（正反菌落直径及生长速度；??２）菌株显微形态观察：挑取少量孢子划线接种于平板培养基的一侧，接种线处插入玻片，培养一周左右，将盖玻片置于载玻片上，用显微镜下观察菌丝形态。??３．１．２．４菌种鉴定??菌种鉴定参考２．４．１。??３．１．３产酶条件优化??将单菌接种在产酶培养基上进行固态发酵产酶（图３－１?）。产酶培养基成分为：玉米秸秆麦麸ｌｇ、营养液６ｍＬ，固液比?１：２，?ｐＨ自然；营养液：（ＮＨ４）２Ｓ〇４?２ｇ／Ｌ，ＭｇＳ〇４?５ｇ／Ｌ，ＫＨ２Ｐ〇４?８ｇ固态发酵培养获得纤维素酶粗酶液。具体产酶方法为：将单菌接种于平板培养基中培养３ｄ备菌悬液，向产酶培养基中接种〇．３ｍＬ菌悬液，３０?°Ｃ培养３ｄ；向产酶培养基中按固液比为１：比例加入灭菌去离子水，震荡浸提ｌｈ，离心取上清液即为粗酶液。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]哈茨木霉和黑曲霉粗酶液预处理改善秸秆产甲烷性能[J]. 赵肖玲,郑泽慧,蔡亚凡,赵宇宾,罗凯,崔宗均,王小芬. 农业工程学报. 2018(03)
[2]秸秆预处理方法的研究进展[J]. 丁梁斌. 安徽化工. 2017(06)
[3]1995—2014年中国农作物秸秆沼气化碳足迹分析[J]. 王艺鹏,杨晓琳,谢光辉,程娅丽. 中国农业大学学报. 2017(05)
[4]纤维素酶解的研究进展[J]. 燕亚平. 山东工业技术. 2017(10)
[5]秸秆生物预处理技术现状及研究进展[J]. 贾琳,刘杨,张智理,李再兴. 煤炭与化工. 2017(04)
[6]中温NaOH预处理对玉米秸秆发酵产沼气的影响[J]. 袁志慧,尤朝阳,王磊,张路广. 江苏农业科学. 2016(06)
[7]试论全生物质农业[J]. 石元春. 科技导报. 2016(13)
[8]木质素氧化降解研究进展[J]. 张海峰,杨军艳,吴建新,毛海舫,孙小玲. 有机化学. 2016(06)
[9]秸秆厌氧发酵产沼气技术研究进展[J]. 夏江华,付龙云,杨光,姚利,王振,王艳芹. 山东农业科学. 2015(12)
[10]酶水解过程中纤维素聚合度和结晶度的变化[J]. 杜敏,李新平,陈立红,王志杰,李鸿魁. 林产化学与工业. 2015(05)
博士论文
[1]难、易降解高含固率物料两相分区一体工艺下的高效产甲烷机制[D]. 赵野.中国农业大学 2017
[2]纤维质农业废弃物微好氧酸化机理及高含固率两相厌氧发酵工艺研究[D]. 于佳动.中国农业大学 2017
[3]单相与两相厌氧工艺发酵特性及微生物生态机理比较研究[D]. 任济伟.中国农业大学 2015
[4]生物纤维原料汽爆预处理技术与应用研究[D]. 王许涛.河南农业大学 2008
硕士论文
[1]规模化秸秆沼气反应器中微生物群落结构分析[D]. 崔文文.中国农业科学院 2013
[2]酸预处理玉米秸秆与牛粪混合厌氧发酵试验研究[D]. 田永兰.华北电力大学 2012
[3]牲畜粪便与秸秆混合的厌氧发酵特性及工艺优化[D]. 王晓娇.西北农林科技大学 2010
本文编号：3514743
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图I-2木质纤维素结构示意图:纤维素、半纤维素和木质紊(Zahidetal,2014)
日产甲烷量??据日产沼气量和甲烷含量计算日产甲烷量。使用公式（２－３）计算（赵肖玲等，２０１８）：??＾ｍｅｔｈａｎｅ＝?＾ｂｉｏｇａｓｘ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ?ａｄｄｅｄ?公式（２－３中Ｆｍｅｔｈａｎｅ为日产甲院体积，ｍＬ／ｇ：?Ｆｂｉ〇ｇａｓ为日产沼气体积，ｍＬ；?＼（／ＣＨ４为日产沼气中甲焼；?７５ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓａｃｉｄｅｄ为添加原料的总干物质质量，ｇ。??生物分析??真菌鉴定??菌基因组ＤＮＡ使用Ｅｚｕｐ柱式真菌基因组ＤＮＡ抽提试剂盒（ＳＫ８２５９）标准抽提步骤提取菌通用引物ＩＴＳ１／ＩＴＳ４：扩增序列，ＰＣＲ反应后１％琼脂糖凝胶电泳，１５０Ｖ、１００ｍＡ电泳２０ｍ之后纯化回收，克隆测序（由上海生工股份有限公司完成），并提交ＧｅｎＢａｎｋ注册。??发酵液总细菌ＤＮＡ提取??细菌ＤＮＡ基于改进的方法提取（ＹｕａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎａｒｋ，２００４；于佳动，２０１７）?〇??
向２ｍＬ灭菌离心管中加入０．９ｍＬ０．９％的生理盐水，尽可能多的接种菌种，加入０．６ｍＬ８０油，混匀置于－３０?°Ｃ冰箱中长期保存。??３．１．２．３真菌的形态学观察??１）菌落观察：用玉米秸秆粉固体培养基３０?°Ｃ培养５ｄ，观察菌落表面状态、颜色（正反菌落直径及生长速度；??２）菌株显微形态观察：挑取少量孢子划线接种于平板培养基的一侧，接种线处插入玻片，培养一周左右，将盖玻片置于载玻片上，用显微镜下观察菌丝形态。??３．１．２．４菌种鉴定??菌种鉴定参考２．４．１。??３．１．３产酶条件优化??将单菌接种在产酶培养基上进行固态发酵产酶（图３－１?）。产酶培养基成分为：玉米秸秆麦麸ｌｇ、营养液６ｍＬ，固液比?１：２，?ｐＨ自然；营养液：（ＮＨ４）２Ｓ〇４?２ｇ／Ｌ，ＭｇＳ〇４?５ｇ／Ｌ，ＫＨ２Ｐ〇４?８ｇ固态发酵培养获得纤维素酶粗酶液。具体产酶方法为：将单菌接种于平板培养基中培养３ｄ备菌悬液，向产酶培养基中接种〇．３ｍＬ菌悬液，３０?°Ｃ培养３ｄ；向产酶培养基中按固液比为１：比例加入灭菌去离子水，震荡浸提ｌｈ，离心取上清液即为粗酶液。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]哈茨木霉和黑曲霉粗酶液预处理改善秸秆产甲烷性能[J]. 赵肖玲,郑泽慧,蔡亚凡,赵宇宾,罗凯,崔宗均,王小芬. 农业工程学报. 2018(03)
[2]秸秆预处理方法的研究进展[J]. 丁梁斌. 安徽化工. 2017(06)
[3]1995—2014年中国农作物秸秆沼气化碳足迹分析[J]. 王艺鹏,杨晓琳,谢光辉,程娅丽. 中国农业大学学报. 2017(05)
[4]纤维素酶解的研究进展[J]. 燕亚平. 山东工业技术. 2017(10)
[5]秸秆生物预处理技术现状及研究进展[J]. 贾琳,刘杨,张智理,李再兴. 煤炭与化工. 2017(04)
[6]中温NaOH预处理对玉米秸秆发酵产沼气的影响[J]. 袁志慧,尤朝阳,王磊,张路广. 江苏农业科学. 2016(06)
[7]试论全生物质农业[J]. 石元春. 科技导报. 2016(13)
[8]木质素氧化降解研究进展[J]. 张海峰,杨军艳,吴建新,毛海舫,孙小玲. 有机化学. 2016(06)
[9]秸秆厌氧发酵产沼气技术研究进展[J]. 夏江华,付龙云,杨光,姚利,王振,王艳芹. 山东农业科学. 2015(12)
[10]酶水解过程中纤维素聚合度和结晶度的变化[J]. 杜敏,李新平,陈立红,王志杰,李鸿魁. 林产化学与工业. 2015(05)
博士论文
[1]难、易降解高含固率物料两相分区一体工艺下的高效产甲烷机制[D]. 赵野.中国农业大学 2017
[2]纤维质农业废弃物微好氧酸化机理及高含固率两相厌氧发酵工艺研究[D]. 于佳动.中国农业大学 2017
[3]单相与两相厌氧工艺发酵特性及微生物生态机理比较研究[D]. 任济伟.中国农业大学 2015
[4]生物纤维原料汽爆预处理技术与应用研究[D]. 王许涛.河南农业大学 2008
硕士论文
[1]规模化秸秆沼气反应器中微生物群落结构分析[D]. 崔文文.中国农业科学院 2013
[2]酸预处理玉米秸秆与牛粪混合厌氧发酵试验研究[D]. 田永兰.华北电力大学 2012
[3]牲畜粪便与秸秆混合的厌氧发酵特性及工艺优化[D]. 王晓娇.西北农林科技大学 2010
本文编号：3514743
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