嗜酸性氧化亚铁硫杆菌启动子筛选和亚铁氧化基因敲除株转录组分析

发布时间：2020-05-26 17:02

【摘要】：生物冶金技术是利用自然界的微生物对矿石进行生物氧化,在其自身的代谢作用下加速矿石中的金属矿物转化成金属氧化物的技术,又称为生物浸出技术。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.ferrooxidans)是生物冶金中的优势菌种,是一种重要的冶金工业微生物。该菌既能以亚铁离子作为唯一生长能源,又能以单质硫或还原性无机硫化物获得能量和还原力用于自身的代谢,其能量代谢途径具有多样性和复杂性。深入探究该菌的遗传背景及其能量代谢系统,不仅能在理论上阐明亚铁代谢和硫代谢的关系,也能促进该菌在生物冶金中的利用效率。关于A.ferrooxidans的亚铁氧化代谢机制尚不明确,由Bonnefoy等人基于模式菌株A.ferrooxidans ATCC 23270提出的亚铁氧化电子传递模型,目前在国际上被普遍接受。基于该亚铁氧化电子传递模型,Cyc2是唯一的第一个电子受体蛋白,实验室前期敲除了cyc2基因及其替代基因AFE_1428,并没有阻断亚铁氧化能力。在此基础上,为了提高A.ferrooxidans的亚铁氧化效率,本文从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌高效启动子的筛选和亚铁氧化相关基因敲除突变株的转录组学分析两个方面展开研究,进行了以下工作。将A.ferrooxidans的转录组测序数据,进行生物信息学分析预测,在全基因组范围内寻找可能的高效启动子序列,重点分析亚铁代谢相关基因的转录调控元件和启动子活性,为在A.ferrooxidans中基因的高效表达提供备选的启动子序列。将生物信息学预测的11个转录水平较高基因的启动子分别与报告基因gusA连接,在大肠杆菌中异源表达检测启动子活性。11个检测的A.ferrooxidans启动子在大肠杆菌中的活性6个比Ptac强,2个比Ptac弱一些,依次为P0781P2727P1658P2254P2026P2278PtacP0422P2998,剩下3个(P0041、P0696和P1636)启动子的活性非常低,尚待确认。进一步将这三个启动子和两个有活性的启动子(P2026和P2998)一起在A.ferrooxidans中检测活性,结果是1个比Ptac强,2个比Ptac弱一些,依次为P2026PtacP2998P0041,P0041在A.ferrooxidans中具有明显的启动子活性,但是P0696和P1636这两个启动子同样几乎没有活性,启动子检测结果与在大肠杆菌中相似,分析这些转录活性较高基因启动子的活性有较大差异的原因可能是因为启动子受不同程度的表达调控和启动子预测软件的准确率问题等。高效启动子的获得,有利于构建亚铁氧化代谢能力提高的浸矿工程菌。为进一步研究嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化关键基因cyc2、AFE_1428的功能及其他功能替代基因,以实验室在前期工作中获得的A.ferrooxidans基因敲除突变株△cyc2、△AFE_1428和△cyc2-△AFE_1428为实验材料,以AA ferrooxidans ATCC 23270野生型为对照,通过检测分别以亚铁和硫粉为能源培养时的生长和亚铁氧化,分析确定了收集菌体的培养时期,准备样品进行了转录组测序。通过分析比较各敲除突变菌株与野生型菌株在以亚铁为能源培养条件下相关基因的表达变化,找出了显著差异表达的基因,进一步对这些基因进行了Pathway和GO功能分析,并用RT-qPCR方法检测了A.ferrooxidans 亚铁氧化代谢相关基因和以上显著差异表达的基因的表达量,验证了转录组数据的可靠性。最后,根据转录组数据、RT-qPCR结果和生物信息学预测,分析了cyc2、AFE_1428和几个显著差异表达基因在A.ferrooxidans亚铁氧化代谢中的功能,可通过下一步实验进一步验证。综上,A.ferrooxidans高效启动子的获得和亚铁氧化相关基因敲除突变株的转录组测序及数据分析,为进一步研究该菌的亚铁氧化电子传递模型以及其他亚铁氧化电子关键传递体蛋白提供了思路和数据支持。
【图文】：

模型图,硫杆菌属,嗜酸菌,硫氧化

逡逑图１．２。然而经生物信息学分析发现，，Ａ／ｅｒｒａａｘ／而ｍＡＴＣＣ２３２７０基因组中并没逡逑有ＳＤＯ的编码基因。随后Ｑｕａｔｒｉｎｉ等人推测，可能是异二硫化物还原酶复合物逡逑ＨｄｒＡＢＣ在单质硫最初氧化过程中起作用（Ｑｕａｔｒｉｎｉｄａ／．，２００９），如图１．１。但是逡逑该途径很不确定，相关基因的编码功能也仅基于生物信息学分析，缺少实验证据。逡逑本实验室，在基因组中找到ＳＤＯ的一个潜在的编码基因ＡＦＥ＿０２６９，并通过基逡逑因克隆和在大肠杆菌中异源表达，证实ＡＦＥ＿０２６９基因的编码产物具有ＳＤＯ活逡逑性，但进一步对该基因在Ａ声／ｒｏｏｘ／Ｗｏｒａ中将基因敲除和过表达，结果显示ＳＤＯ逡逑酶的功能可能与细胞内硫化物的解毒更相关

氧化亚铁硫杆菌,亚铁,嗜酸性,细胞色素

Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆＦｅ２＋邋ｏｘｉｄａｔｉｏｎ邋＼ｎ邋Ａ．邋ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ邋ＡＴＣＣ邋２３２７０邋（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ邋ａｎｄ逡逑Ｈｏｌｍｅｓ，邋２０１２）．逡逑由图１．３可以看出，Ｆｅ２＋氧化产生的电子是以“顺电势”梯度和“逆电势”梯度逡逑两条电子传递途径进行的。“顺电势”梯度电子传递途径为：Ｆｅ２＋—细胞色素蛋白逡逑Ｃｙｃ２－＞铜蓝蛋白Ｒｕｓ—细胞色素蛋白Ｃｙｃｌ—细胞色素氧化酶0２，；邋“逆电势”逡逑梯度电子传递途径为：Ｆｅ２＋—细胞色素蛋白Ｃｙｃ２—铜蓝蛋白Ｒｕｓ—细胞色素蛋白逡逑ＣｙｃＡｌ—细胞色素复合体—醌池—ＮＡＤＨ－Ｑ还原酶—ＮＡＤ＋。根据电子传递逡逑链中各传递体氧化还原电位的研宄结果显示，也支持该模型（Ｂｉｒｄ以《／．，２０１１）。逡逑其中，Ｆｅ２＋氧化产生的电子大部分沿“顺电势”梯度电子传递途径，从外膜进入到逡逑细胞质中，最终传递给0２，并与质子结合生成Ｈ２０。只有大约５％的电子经由“逆逡逑电势”梯度电子传递途径，在ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ还原酶的作用下使ＮＡＤ（Ｐ）邋＋还原为逡逑ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，生成细胞固定Ｃ０２和参与有氧代谢所需的还原力。逡逑在该模型中，编码与Ｆｅ２＋氧化相关电子传递体蛋白的基因主逡逑要存在于两个转录单元中。在“顺电势”梯度电子传递链中
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TF18;Q78

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