嗜酸性喜温硫杆菌渗透压调节子ompR的无痕敲除及其相关性质的研究
发布时间：2020-07-16 21:26
【摘要】：嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,.caldus)是一种专性自养的硫氧化细菌,能够通过还原性或部分还原性的硫化物的氧化反应中获得其生长所必须的能量和还原力,以卡尔文循环固定空气中的CO2作为碳源,通常分布于酸性矿水、硫化矿床中,是生物浸矿中的优势菌,在生物冶金、含硫废水的处理和煤的脱硫等方面起着重要的作用。嗜酸硫杆菌由于其特殊的生存方式和在自然界硫循环中的重要地位,一直以来受到人们的广泛关注。但是,由于该菌化能自养的特性,生长缓慢且细胞得率较低,给研究带来了一定的困难。因此,研究A.caldus的生长代谢及其对环境的适应性是当前的首要课题。细菌在感知高渗透压环境并快速应答过程中,渗透压调控子(osmolarity response regulator,ompR)起着关键作用,相关研究在肠杆菌科中研究最多也最深入。越来越多的研究显示,除了渗透调节外,OmpR还有其他的调控功能,但在专性化能自养的嗜酸性喜温硫杆菌中OmpR怎样应对浸矿环境的高渗透压胁迫,它又直接调控哪些基因的表达并发挥其调控功能,至今未见报道。通过前期基因组测序了解到A.caadus MTH-04基因组中ompR基因存在两个拷贝,分别为orf1207和orf2590。因此,探究ompR的调控机制不仅有助于探究A.caldus MTH-04如何适应环境中的渗透压的改变,而且对于完善硫代谢机制也有着及其重要的意义。本论文在国际上首次对A.caldus中ompR基因展开研究,主要包括以下几个方面:第一,首次在A.caldus中实现ompR基因的无痕敲除。根据本实验之前建立的A.caldus基因无痕敲除系统,对A.caldus的orf1207和orf2590进行了无痕敲除,从而获得了 株突变菌株,分别为 A.caldus(△orf1207)、A.caldus(△orf2590)及 A.caldus(△orf1207△orf2590);第二,首次在A.caldus中实现ompR突变体的表型分析。测定三株突变株与野生型菌株在不同渗透压下的生长曲线,比较菌株对高渗透压的敏感性,推测ompR2590在渗透压调节中发挥着更大的作用;利用流式细胞仪检测高渗透压下细菌的生理状态,发现高渗透压长时间刺激菌株后,细胞膜的通透性增加,菌株的细胞膜遭到破坏;第三,首次在A.caldus中探究ompR调控元及其调控机制。利用链特异性转录组测序技术,在mRNA的水平上比较了在高渗透压刺激下与野生型菌株相比ompR突变株基因差异表达情况;利用实时荧光定量PCR(Real time RT-PCR)对转录组测序筛选出并预测可能受OmpR调控的基因做了进一步验证;第四,首次对A.caldus的ompR基因进行了分析鉴定,成功的在E.coli BL21(DE3)中实现ompR(orfl207)及ompR(orf2590)的异源表达,并获得纯化的OmpR蛋白;使用等温滴定量热仪MicroCaliTC 200初步测得ompR2590能够与tetH发生相互作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TF18
【图文】：
ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ｏｍｐ／？）起着关键作用，通过全基因组测序发现ｏｗ／？／？基因在逡逑Ａ逦血ｙ邋ＭＴＨ－０４基因组中含有两个拷贝，分别为0＃２０７和0的５９０，其在Ａ逡逑ｃＷ—？邋ＭＴＨ－０４基因组中的位置如图２－１所示，且两个ＯｍｐＲ蛋白氨基酸相似度逡逑为４１％邋（如图２－２），另外通过ＢＬＡＳＴ发现0的５８９邋（Ａ邋ｃａ／血ｓ’邋ＭＴＨ－０４注释为逡逑ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）与ｃａ／ｔ／ｗｓ邋ＳＭ－１中ＥｎｖＺ蛋白序列完全相同，因此认为逡逑0＂２５８９是ｅｎｖＺ基因，为Ａ邋ｒａ／ｃ／奶邋ＭＴＨ－０４添加新的注释，比对结果如图２－３所逡逑示。通过在ＡｃａＷｗｓＭＴＨ－０４中实现0师尺基因的无痕敲除，并与野生型菌株相逡逑比较，对该基因的敲除将影响菌株生长代谢及其他基因的转录，因此，对Ａ邋ｃａ／Ｊｗ逡逑ＭＴＨ－０４中ｏ—进行敲除，有利于深入解析NB邋ｃｆｌ／血？邋ＭＴＨ－０４的代谢系统。逡逑根据本实验室前期建立了邋Ａ邋ｃａＷｗ邋ＭＴＨ－０４基因的无痕敲除方法，基因无痕逡逑敲除方法的流程如图２－４所示
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过菌落ＰＣＲ筛选单交换子，初步筛选到阳性单交换子后接种于液体培养基中扩逡逑大培养，提取基因组后使用ｏｒｉＴＲＰ４和同源臂两种引物再次验证单交换子。引物逡逑设计原理如图２－７所示：逡逑」＾0７内引＾邋ＣｏｌＥＩ邋ｏｒｉ逦物／Ｉ－Ｓｅｃ邋丨＿邋ｌｆ0７内引物逡逑ｕｐ逦ｄｏｗｎ逦ＡｍｐＲ邋ｏｒｉＴ邋Ｋｍ邋ｕｐ邋ｄｏｗｎ逡逑—？逦u嚕义希掊危祝椋欤溴澹簦穑邋义希酰稹瑰危体澹洌铮鳎铄义贤迹玻返ソ换蛔由秆∫锷杓剖疽馔煎义希疲椋纾酰颍邋澹玻峰澹模椋幔纾颍幔礤澹铮驽澹穑颍椋恚澹蝈澹妫铮蝈澹螅悖颍澹澹睿椋睿珏澹螅椋睿纾欤邋澹悖颍铮螅螅铮觯澹蝈义险攵宰陨敝柿＃穑停模保梗铮颍椋裕耍恚停茫由咸赜械模铮颍椋藻澹遥校葱蛄猩杓埔铮铮颍椋裕啤㈠义希铮颍椋裕遥ü妫玻埃保常吧停铃
本文编号：2758528
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TF18
【图文】：
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过菌落ＰＣＲ筛选单交换子，初步筛选到阳性单交换子后接种于液体培养基中扩逡逑大培养，提取基因组后使用ｏｒｉＴＲＰ４和同源臂两种引物再次验证单交换子。引物逡逑设计原理如图２－７所示：逡逑」＾0７内引＾邋ＣｏｌＥＩ邋ｏｒｉ逦物／Ｉ－Ｓｅｃ邋丨＿邋ｌｆ0７内引物逡逑ｕｐ逦ｄｏｗｎ逦ＡｍｐＲ邋ｏｒｉＴ邋Ｋｍ邋ｕｐ邋ｄｏｗｎ逡逑—？逦u嚕义希掊危祝椋欤溴澹簦穑邋义希酰稹瑰危体澹洌铮鳎铄义贤迹玻返ソ换蛔由秆∫锷杓剖疽馔煎义希疲椋纾酰颍邋澹玻峰澹模椋幔纾颍幔礤澹铮驽澹穑颍椋恚澹蝈澹妫铮蝈澹螅悖颍澹澹睿椋睿珏澹螅椋睿纾欤邋澹悖颍铮螅螅铮觯澹蝈义险攵宰陨敝柿＃穑停模保梗铮颍椋裕耍恚停茫由咸赜械模铮颍椋藻澹遥校葱蛄猩杓埔铮铮颍椋裕啤㈠义希铮颍椋裕遥ü妫玻埃保常吧停铃
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