嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的碳代谢研究

发布时间：2020-09-19 08:06

　　嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus.ferrooxidans,简称 A.ferrooxidans),是极端嗜酸的革兰氏阴性化能自养菌,属γ-变形杆菌,通过氧化二价铁或还原性硫化物获得能量,通过固定CO2获得主要碳源。该菌在生物冶金、生物脱硫等工业应用中具有重要的价值。实验证明,A.ferrooxidans生长缓慢,仅能利用少量的外源有机质,究其原因,则是该菌具有不完整的中心碳代谢途径。本文主要选择中心碳代谢模型中几个关键酶基因进行了以下几方面的研究,以深入了解该菌的碳代谢途径。山于A.ferrooxdans中糖酵解途径中磷酸果糖激酶的活性较低只有E.coli K12 PFK活性的千分之一,采用实验室建立的无标记基因敲除/置换方法,将K12高活性的pfkA基因成功替换到A.ferrooxidans 的pfkB(AFE_1807)的位置,构建了替换突变株A.ferrooxidansR 12 A。与实验室前期构建的pfkB基因敲除突变株A ferrooxidans△1807和用E.coli K12 pB基因替换自身pfkB基因突变株A.ferrooxidansRK12B 一起,以A.ferrooxidansATCC 23270野生型作对照菌株,对新构建的替换突变株A.ferrooxidansRK12A进行了比较研究,分别以铁、硫粉为能源时的细菌生长特性、葡萄糖的利用能力以及碳代谢相关基因的表达水平的变化。结果显示:以亚铁为能源时,pfkB基因的敲除与置换都不影响该菌的亚铁氧化能力,葡萄糖利用能力变化不大,说明由于在亚铁培养基中葡萄糖的利用非常有限,即使替换了大肠杆菌高活性pfkA基因的突变株RK12A的葡萄糖利用能力也没有明显改变;以硫粉为能源时,置换突变株RK12A和RK12B的细胞浓度、细胞干重、粗酶液的PFK比活和葡萄糖的利用能力都比野生型和敲除突变株△1807高,尤其是本文构建的用大肠杆菌pfkA基因替换的突变株RK12A优势比较明显,说明较高活性的pfkA基因替换后促进了该菌以硫粉为能源的生长和葡萄糖的利用。A.ferrooxidans ATCC 23270中有两个预测的基因编码磷酸转酮酶,分别是AFE_1667和AFE_2053,首先经蛋白序列比对,发现这两个基因均含有转酮酶保守序列和磷酸转酮酶C端保守序列。其次,通过构建AFE_1667和AFE_2053的表达体系,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,从细胞粗酶液中检测到以6-磷酸果糖为底物的磷酸转酮酶酶活,证实了A.ferrooxidans中具有磷酸转酮酶途径。第三,以广泛宿主质粒pJRD215为载体,构建了两基因分别过表达的菌株A.ferrooxidans(pJRD215-1667)和A.ferrooxidans(pJRD215-2053),检测了以硫粉为能源时,菌株的磷酸转酮酶酶活、少长曲线及碳代谢相关基因的转录水平,结果显示:两株过表达菌株都获得了更高的磷酸转酮酶,但是没有表现出生长优势,A.ferrooxidans(pJRD215-1667)反而比野生型对照菌株生长更弱,添加了葡萄糖培养后,菌株的生长都比不添加的有所提高;转录水平方面,两个基因的过表达,使pg/、lk、zwf和pfk都有所上调,说明在一定程度上促进了碳代谢途径的运转。AFE_1667过表达后xfp2上调表达,添加葡萄糖培养的AFE_2053过表达后xfpl有轻微的下调表达,推测XFP1只能以果糖-6-磷酸为底物,XFP2具有双底物的催化功能,即果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸。A.ferrooxidans具有完整的磷酸戊糖途径,为了验证该菌是否经过该途径代谢葡萄糖,对该途径的关键酶基因pgd AFE_2024)和zwf(AFE_2025)进行了过表达研究。首先将共转录的这两个基因克隆至pJ RD215上,导入A.ferrooxidans中获得工程菌A.ferroxidans(pJRD215-2024-2025),以硫粉为能源,检测了工程菌的生长及碳代谢相关基因转录水平。不添加葡萄糖时,工程菌比对照菌株生长弱,添加了 1 g/L的葡萄糖后,工程菌的生长比对照菌略有提高。基因过表达后,糖酵解途径的glk上调表达,pgi明显下调,意味着生成的葡萄糖-6-磷酸流向糖酵解途径的量减少,史多流向了HMP途径;磷酸转酮酶基因xfp-2发生了上调表达,而xfp1有轻微下调,推测HMP途径产生大约等量的木酮糖-5-磷酸和果糖-6-磷酸,刺激了具有双底物功能的XFP-2上调表达,仅能催化果糖-6-磷酸的XFP-1下调表达。研究比较了葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖对A.ferrooxidans生长的影响,其中蔗糖与葡萄糖促进作用较为显著,又设置了蔗糖浓度梯度,探究不同浓度的蔗糖对A.ferrooxidans生长的影响,结果显示蔗糖浓度低于4%时,菌株的生长量和对蔗糖的利用随着浓度的升高而提高,高于4%后都会下降。由于酸性条件下蔗糖的降解,推测该菌主要通过代谢葡萄糖和果糖消耗蔗糖。研究发现1%蔗糖培养的细菌中参与蔗糖水解产物葡萄糖和果糖代谢相关基因上调表达,如HMP途径的关键基因zwf,EMP途径的pfkB,TCA循环的pdhA、citz,,而glgA、fbp的上调表达说明促进了糖原合成。但pgi、glk、xfpl基因下调表达,推测可能果糖快速生成的1,6-二磷酸果糖不断积累对葡萄糖的EMP途径有反馈抑制,更多流向了 HMP途径。此外,以β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)为报告基因,构建了含在Ptac启动子下四种不同起始密码子gusA基因的重组质粒,分别比较了不同起始密码了 ATG、TTG、GTG和CTG的gusA基因在大肠杆菌和A.ferrooxidans中表达的酶活性。结果显示,与大肠杆菌一样,在A.ferrooxidans中,以硫粉或亚铁为能源时,起始密码子的强弱顺序均为ATGTTGGTGCTG,因此,除了启动子外,可以利用不同起始密码子的翻译水平,控制基因在A.ferrooxidans中的表达,为调控外源基因在A.ferrooxidans中表达的强弱提供理论依据。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q935;TF18
【部分图文】：

模型图,氧化亚铁硫杆菌,固氮,嗜酸性

．３．４二氧化碳固定机制．作为一种化能自养型细菌，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌通过固定空气中获取碳源。在４邋．／＾ｒｏｏｘ／而ｒａＡＴＣＣ２３２７０基因组上发现了二氧化碳固定因，主要分布在五个基因簇上，分别编码两个拷贝的Ｉ型Ｒｕｂｉｓｃｏ复合物贝的ｎ型Ｒｕｂｉｓｃｏ复合物、浓缩二氧化碳的羧化体复合物以及多个中间物酶等（ＶａｌｃＭｓ邋ｅｒａ／．，２００８ｂ）。逦．逡逑Ｅｓｐａｒｚａ等通过ＥＭＳＡ实验证实了Ａ逦基因组中转录因子Ｃｂ合八ｃ抑２和的启动子上游区域，但是不能结合到上游，囟细胞中调控相应基因的表达，可能与＜：０２浓度有关（Ｅｓｐａｒｚａ邋ｗｏ／．，邋２０１０）纵子含有ｃ？况在（：０２浓度低时发挥作用，因为羧酶体能浓缩ＣｕｂｉｓＣＯ的催化能力（Ｐｒｉｃｅ邋Ｗ邋ａ／．，邋２００８；邋Ｓｈｉｖｅｌｙ邋ｄ邋0／．，邋１９９８）邋；邋ｃ从２操纵相＜９，高浓度Ｃ０２时发挥作用（ＴｏｙｏｄａｄＷ．，２００５）邋；邋ｃＺ＞Ｗ含有ＣＢＢ

甘露醇,培养基,磷酸果糖激酶,重组质粒

０．２５邋Ｉ逡逑０邋１逡逑图２．丨重组质粒ｐＵＣ１９－ｐＡｒ酶切验证图谱逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ．逡逑Ｌａｎｅ邋１：邋ｐＵＣ１９；邋Ｌａｎｅ邋２：邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ；邋Ｌａｎｅ邋３：邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ（Ａ７？ａＩ）；邋Ｌａｎｅ邋４：邋ｐＡｒ（Ａ？？ａＩ）；邋Ｌａｎｅ５：逡逑ｐＵＣ邋１９（＾７？＾１）；邋Ｌａｎｅ邋Ｍ：邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ邋ＰｌｕｓＩＩ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ｗｉｔｈ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅｌｅｆｔ邋ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｓｉｚｅｓ逡逑ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．逡逑为了进一步验证克隆的；ｒ邋（／Ｖ－／＃木ｒｎｉ５７７邋）单元表达的蛋白是否具有ＰＦＫ逡逑活性，将重组质粒ｐＵＣ１９－ＰＡｒ和ｐＵＣ１９空载体分别转入磷酸果糖激酶缺陷型菌株逡逑￡．邋ｆ0＂ＤＦ１０１０中。以ｆｃｏ／／Ｋ１２作为正对照，以ＤＦ１０１０为负对照，在Ｍ６３！甘露逡逑醇平板上划线培养。菌落生长结果（如图２．２所示）显示￡．邋ｃｏ／／邋ＤＦ１０１０和￡．邋ｃ0／／逡逑ＤＦ１０１０邋（ｐＵＣ１９）不能生长，而五．ｃｏ／／邋Ｋ１２和￡．邋ｃｏ＂邋ＤＦ１０１０（ｐＵＣ１９－ｐＡｒ）均能长出逡逑较大菌落，表明ｐＵＣ１９－ｐＡｒ所编码的蛋白产物具有ＰＦＫ活性。逡逑Ｌ邋＾，０＼ｊ逡逑图２．２￡．0５／／１＜：１２

突变株,野生型,验证结果,质粒

ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ质粒，再用引物对ＳＭＦ／ＳＭＲ扩增质粒ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ上的链霉素抗逡逑性基因片段进行？0１磕证，以野生型左／阶0（？油似八丁（：０邋２３２７０为阴性对１＾，质逡逑粒ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ为正对照。结果如图２．９所示，正对照质粒可以扩增出约７００邋ｂｐ逡逑的Ｓｍ片段，而突变株ＲＫ１２Ａ和野生型菌株都没有，说明质粒丢失成功。逡逑ＢＨ｜逡逑０．７５逡逑图２．９邋ｐＭＳＤｌ－Ｉ－Ｓｃｅ丨质粒丢失验证逡逑Ｆｉｇ．邋２．９邋ＰＣＲ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＭＳＤｌ－Ｉ－Ｓｃｅｌｌｏｓｔ邋ｆｒｏｍ邋ＲＫ１２Ａ．邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋Ｓｍ逡逑ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｐａｉｒｓ邋ＳＭＦ／ＳＭＲ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｏｆ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｆｒｏｍ邋Ａ．逡逑ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ邋ＡＴＣＣ邋２３２７０邋（Ｌａｎｅ邋１）

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