石灰性紫色水稻土中nirS和nosZ基因对不同施肥处理的响应特征及其垂直分布

发布时间：2020-07-03 21:04

【摘要】：探究水稻田生态系统反硝化微生物多样性与土壤氮素循环之间的关系,是深入评价农田土壤质量与功能的新切入点。石灰性紫色水稻土是四川乃至全国都至关重要的农业土壤,为保护该类土壤,四川省于20世纪80年代在遂宁市船山区建立了“NPK长期定位施肥”试验点。依托该平台,结合化学分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、系统发育分析、末端限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)还有实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)等分子分析技术,对不同施肥制度下石灰性紫色水稻土中的亚硝酸盐还原酶基因(nirS)和一氧化氮还原酶基因(nosZ)的群落结构、丰度和垂直分布特征进行分析。以期揭示反硝化细菌对不同施肥制度的响应特点及在其土壤中的垂直分布特征,进而认识石灰性紫色水稻土生态系统氮素循环特征,为在该类土壤上建立合理氮肥施用制度、保护土壤质量提供重要依据。主要研究结果如下:(1)对不同施肥制度下石灰性紫色水稻土理化性质进行分析,结果显示:相对于无肥处理,施肥会降低石灰性紫色水稻土 pH和硝态氮含量,而增加土壤有机质、全氮和氨态氮含量。随土壤深度增加,土壤pH增加,全氮和硝态氮含量降低,氨态氮含量变化趋势不明显。根据硝态氮剩余量法测定反硝化酶活,结果显示:0-20 cm层土壤的反硝化酶活明显高于其他层次;其中氮磷肥施肥制度对反硝化酶活的促进作用最明显。皮尔逊相关分析显示:反硝化酶活与pH值极显著负相关(r=-0.46,p0.01),而与硝态氮极显著正相关(r = 0.785,p0.01);而它与nosZ和nirS基因拷贝数无明显相关性。反硝化酶活与nosZ基因群落结构显著相关(p0.05由蒙特卡罗指数分析),而与nirS基因的群落结构无明显相关性。(2)利用实时荧光定量PCR对16S rRNA和nirS、nosZ基因拷贝数进行定量分析,结果显示:在0-20 cm层土壤,nirS和nosZ基因拷贝数均明显高于其它层次。施肥制度对三种基因的拷贝数均有促进作用,但无机肥配施农家肥处理对16S rRNA和nosZ基因的拷贝数促进作用更明显;而nirS基因拷贝数对施肥制度的变化并不敏感。根据两个功能基因所占16SrRNA比例,nosZ基因反硝化细菌在石灰性紫色水稻土中丰度更高。皮尔逊相关分析显示:nirS和nosZ基因拷贝数均与土壤有机质呈正相关。(3)利用DGGE对nirS基因反硝化细菌群落结构进行分析,不同施肥制度下nirS基因反硝化细菌群落结构表现出明显的差异性。在0-20 cm层,无机肥配施有机肥的施肥制度下nirS基因反硝化细菌的多样性指数和丰富度高于无机肥施肥制度,但其他层次间的差异不明显。就土壤层次而言,在60-90 cm层,nirS基因反硝化细菌多样性指数和丰富度均最小。根据切胶回收条带测序,共得到9条序列。3条序列未找到可培养菌株,剩余6条序列均属于变形菌门。其中,大部分属于β-变形菌门。(4)利用T-RFLP对nirS和nosZ基因反硝化细菌群落结构进行分析,结果表明:nirS基因各土壤层次的T-RFs片段的丰富度变化不明显;而nosZ基因在0-20 cm层土壤中丰富度最高。在0-20cm层土壤中明显表现出无机混合肥配施农家肥制度下nirS和nosZ基因反硝化细菌群落结构更为复杂;而深层土壤中施肥制度对群落结构的影响并不明显。nirS基因各土壤层次中的优势片段为75 bp、80 bp和115 bp;而nosZ基因4个层次不存在共有的优势片段。nirS基因反硝化细菌群落中的优势片段115bp属于Magnetospirillum(AB937700),片段75bp属于Pseudomonas stutzeri(CP011854);nosZ基因反硝化细菌群落中,0-20 cm 和 20-40 cm层土壤中的优势片段90 bp和355bp属于Azospirillum(Rhodospirillales)。而40-60 cm 和 60-90 cm 中的优势片段 300 bp 属于 Bradyrhizobium(Rhizobiales)。根据nosZ基因克隆产物的酶切图谱,对酶切类型不同的克隆产物进行测序。克隆序列比对相似的可培养菌株菌均属于变形菌门,且α-变形门细菌占主导地位。(5)利用典范对应分析或冗余分析对反硝化细菌群落结构与环境参数进行相关性分析,结果显示:pH(p0.05)和NH4+-N(p0.05)是影响石灰性紫色水稻土nir 基因反硝化细菌群落结构的主要因子,土壤有机质、总氮还有pH值是影响石灰性紫色水稻土nosZ基因群落结构的关键环境因子(p0.05)。总体而言,长期定位施肥对石灰性紫色水稻土反硝化酶活和功能(nirS和nosZ)基因反硝化细菌群落结构和丰度及其垂直分布的影响不同。无机肥更促进反硝化酶活。表层土(0-20cm)是nirS和nosZ基因主要存在层次,且群落结构表现出与其他层次明显地差异。无机肥配施农家肥明显提高nosZ基因拷贝数和群落结构的复杂度,而施肥制度对nirS基因的拷贝数影响较小。nirS基因反硝化细菌均属于变形菌门,且β-变形菌门占主导地位;nosZ基因反硝化细菌均属于变形菌门,但α-变形菌门占主导地位。除此之外,影响两个功能基因群落结构的最主要环境因子是土壤pH值。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S151.9
【图文】：

功能基因,反硝化,功能,反硝化细菌

１．２反硝化过程相关功能基因及其研究现状逡逑因为自然生态系统中反硝化微生物多数是不可培养，且种类繁多，致使长逡逑期以来对反硝化细菌的研究不够深入和系统。近年来，分子生物技术的发展为解逡逑决这一问题提供了契机，但仅采用常规的１６ＳｒＲＮＡ测序的方法研宄反硝化细菌逡逑也存在着极大困难。因为己有研宄表明，反硝化细菌不能按照传统的分类学方法逡逑划分为某些特定种群，即脱氮显型不能从系统发育进化推断。与相对保守的１６Ｓ逡逑ｒＲＮＡ相比，功能基因具有更多的序列变化，利用功能基因可以区分生态功能不逡逑同但亲源相近的微生物种群，但更重要的是利用功能基因可以鉴定生态功能相同逡逑但亲缘关系较远的微生物种群，如反硝化细菌。逡逑反硝化过程由以下四个步骤组成，分别由硝酸还原酶Ｎａｒ、亚硝酸盐还原酶逡逑Ｎｉｒ、一氧化氮还原酶Ｎｏｒ和一氧化亚l#还原酶Ｎｏｓ催化，如图１所示。逡逑Ｎａｒ逦Ｃｄ－Ｎｉｒ逦Ｎｏｒ逦Ｎｏｓ逡逑

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