葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的异源表达及双酶联合降解苏丹染料方法的开发

发布时间：2017-05-12 07:07

  本文关键词：葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的异源表达及双酶联合降解苏丹染料方法的开发，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：葡萄糖氧化酶与辣根过氧化酶在食品、医药、化学检测等许多领域都具有广泛的应用,但是辣根过氧化物酶主要来源于植物,其提取、分离和纯化工艺复杂且成本高,而里氏木霉和毕赤酵母都是优良的异源表达真核宿主,适用于大规模的工业化生产应用。本课题试图在里氏木霉和毕赤酵母中进行葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的异源表达,同时对两个酶进行双酶联合降解有毒染料的研究。为获得两种酶以及联合降解有毒染料功能的开发,本文从以下三方面进行了研究。一、通过数据库的挖掘,获得两个酶基因并分别在里氏木霉及毕赤酵母中进行表达。其中在表达葡萄糖氧化酶的里氏木霉重组菌株plcs-ClGo和表达辣根过氧化物酶的里氏木霉重组菌株plsl-Prx所产酶液中酶活很低。而毕赤酵母重组菌株pPIC9K-Go所产酶液中葡萄糖氧化酶酶活为74.3 IU/mL;毕赤酵母重组菌株pPIC9K-Prx所产酶液中辣根过氧化物酶酶活为267.3 IU/L。二、为进一步对葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶功能开发,基于合成生物学理念,将葡萄糖氧化酶与β-葡萄糖苷酶进行融合表达以扩增其底物谱,获得的最佳重组菌株pPIC9K-GH4B,其所表达的葡萄糖氧化酶与β-葡萄糖苷酶酶活最大,分别为16.4 IU/mL和0.77 IU/mL;同时将葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶进行共表达,获得最佳重组菌株pPIC9K-PEVG,得到的葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶酶活分别为20.9 IU/mL和254 IU/L。三、将葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶作用于苏丹染料的降解,研究发现在pH6.0的条件下,加入适量酚类物质能够提高对苏丹Ⅰ进行降解,20μM双酚A条件下,降解率从21.93%提升到87.5%,另外对于苏丹Ⅱ和苏丹Ⅲ进行降解,降解率分别从0提升到58.3%和68.75%。双酶联合降解法利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖缓慢释放过氧化氢,减少了过氧化氢对过氧化物酶的伤害,延长酶的的使用时长。通过加入酚类中间物提升了降解的效率,开发出适用于非碱性天然弱酸性pH值条件下,高效降解苏丹类有毒染料的方案,为毒害物质降解提供了一个新的思路。
【关键词】：葡萄糖氧化酶 辣根过氧化物酶 异源表达 苏丹降解
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;Q814.9
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 背景10-17
• 1.1 葡萄糖氧化酶10-11
• 1.1.1 葡萄糖氧化酶概述10
• 1.1.2 葡萄糖氧化酶的催化反应机制10-11
• 1.1.3 葡萄糖氧化酶的来源及应用11
• 1.2 辣根过氧化物酶11-13
• 1.2.1 辣根过氧化物酶概述11-12
• 1.2.2 辣根过氧化物酶催化反应机制12
• 1.2.3 辣根过氧化物酶对毒害物质的降解12-13
• 1.3 表达系统13-16
• 1.3.1 毕赤酵母表达系统13-15
• 1.3.2 里氏木霉表达系统15-16
• 1.4 本文主要研究内容16-17
• 第2章 材料与方法17-32
• 2.1 实验材料17-24
• 2.1.1 菌株与质粒17
• 2.1.2 主要培养基配方17-20
• 2.1.3 主要试剂配制20-21
• 2.1.4 引物序列21-22
• 2.1.5 主要试剂22-23
• 2.1.6 主要仪器设备23-24
• 2.1.7 实验所设计软件24
• 2.2 实验方法24-32
• 2.2.1 常规分子生物学实验操作24-26
• 2.2.2 里氏木霉结合转移26-28
• 2.2.3 毕赤酵母转化28-30
• 2.2.4 酶活测定30-32
• 第3章 葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶分别在里氏木霉中表达32-38
• 3.1 方法与步骤32-35
• 3.1.1 酶基因的获得32-34
• 3.1.2 重组里氏木霉的构建34-35
• 3.1.3 重组菌株的发酵以及产物的酶活测定35
• 3.2 实验结果与讨论35-37
• 3.2.1 重组里氏木霉的构建35-36
• 3.2.2 酶活分析36-37
• 3.3 小结37-38
• 第4章 葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶在毕赤酵母中表达38-49
• 4.1 方法与步骤38-40
• 4.1.1 重组毕赤酵母的构建38-40
• 4.1.2 重组菌株的发酵以及产物的酶活测定以及酶学性质分析40
• 4.2 实验结果与讨论40-47
• 4.2.1 重组毕赤酵母的构建40-43
• 4.2.2 重组毕赤酵母的发酵43-44
• 4.2.3 酶活分析44-47
• 4.3 小结47-49
• 第5章 酶降解苏丹染料49-66
• 5.1 方法与步骤49-52
• 5.1.1 实验试剂的配置49-50
• 5.1.2 不同酚类物质对苏丹染料降解的影响50
• 5.1.3 底物及产物的检测50-51
• 5.1.4 GOD、HRP浓度,葡萄糖浓度和反应时间对苏丹染料降解的影响51
• 5.1.5 温度,pH对苏丹染料降解的影响51
• 5.1.6 酶偶联反应对苏丹染料降解的影响51-52
• 5.1.7 发酵液对苏丹Ⅰ染料降解52
• 5.2 实验结果与讨论52-64
• 5.2.1 试剂的配置52
• 5.2.2 不同酚类物质对苏丹染料降解的影响52-58
• 5.2.3 GOD、HRP浓度,葡萄糖浓度和反应时间对苏丹染料降解的影响58-60
• 5.2.4 温度,pH对苏丹染料降解的影响60-61
• 5.2.5 酶偶联反应对苏丹染料降解的影响61-64
• 5.2.6 发酵液对苏丹Ⅰ染料降解64
• 5.3 小结64-66
• 第6章 结论与展望66-67
• 6.1 全文总结66
• 6.2 展望66-67
• 参考文献67-72
• 致谢72-73
• 硕士期间发表论文73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 马清河,胡常英,刘丽娜,唐兆宏,王云鹏;葡萄糖氧化酶在果汁保鲜中的应用[J];中国食品添加剂;2005年03期

2 张广栋,罗仓学;生物传感器及其在食品工业中的应用[J];食品研究与开发;2005年01期

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本文编号：359100