咔唑降解菌株的筛选及其邻裂双加氧酶的克隆与鉴定

发布时间：2023-04-12 02:50

　　本研究从吉林化工厂污水排污口於泥、四平金士百啤酒厂污水排污口於泥、四平联合化工有限公司污水排污口於泥和江苏常州咔唑生产厂地表污染土四个样品中分离到12株可以在咔唑为唯一碳源和氮源的CNFMM选择固体平板上良好生长的革兰氏阴性细菌株。通过16S rDNA基因序列比对分析，12个菌株分别属于6个菌属。JH061、PJ062、JS061和JS062四个菌株属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）；JH051、PJ051、PJ052和LH051属于芽孢杆菌（Bacillus sp.）；JH052属于金黄杆菌属（Chryseobacteriumsp.）、JH062属于黄色氢噬胞菌（Hydrogenophaga intermedia）、PJ053属于节杆菌属（Arthrobacter sp.）和PJ061属于Pandoraea sp.。 研究了节杆菌PJ053菌株的最适生长条件以及进化关系。与大肠杆菌JM109相比生长速度稍慢，30℃和pH 7为PJ053菌株的最适培养条件。菌落较光滑，边缘整齐，呈明亮的黄色，菌落形状比较有规则，呈圆形，菌株呈短杆状。进化树表明节杆菌PJ053与四个...

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【学位级别】：博士

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引言
    1. 芳香族化合物生物降解的研究现状
    2. 细菌生物降解途径的遗传与进化
    3. 咔唑降解途径和联苯双加氧酶的研究
        3.1 咔唑降解途径
        3.2 联苯双加氧酶基因簇的研究
        3.3 咔唑降解基因簇与联苯降解基因簇的相关性
    4. 基因工程菌在芳香族化合物生物降解中的应用
    5. 本研究工作的意义及目的
第一章、咔唑降解菌株的富集培养与菌种鉴定
    1. 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 实验仪器
        1.3 实验方法
            1.3.1 咔唑降解菌株的富集培养
            1.3.2 细菌的革兰氏染色
            1.3.3 165 rDNA 基因的克隆与鉴定
            1.3.4 插入片段的序列测定及分析
            1.3.5 PJ053 在不同pH条件下生长曲线的测定
    2. 结果
        2.1 样品的富集培养与菌种的分离纯化
        2.2 菌株的165 rDNA 分子生物学鉴定
        2.3 PJ053 菌株的特性分析
    3. 讨论
第二章 PJ053 菌株中2 , 3 -二羟基联苯双加氧酶(23DHBD) 基因和3, 4 -二羟苯乙酸-2 , 3 -双加氧酶(HPCD) 基因的克隆、鉴定与菌株中基因簇的解析
    1. 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 实验仪器
        1.3 实验方法
            1.3.1 基因组文库的构建
            1.3.2 2 , 3- 二羟基联苯双加氧酶(23DHBD) 基因和3 , 4 - 二羟苯乙酸- 2 ,3-双加氧酶(HPCD) 基因的克隆及过表达载体的构建
            1.3.3 23DHBD 基因在PJ053 基因组DNA 上的定位
            1.3.4 23DHBD 和HPCD 蛋白表达及纯化
            1.3.5 23DHBD 和HPCD 融合蛋白抗体的制备及抗体效价的检测
            1.3.6 23DHBD 和HPCD 蛋白的 Western-blot 检测
            1.3.7 不同菌株中23DHBD 酶活分析
    2. 结果
        2.1 PJ053 基因组文库的构建
            2.1.1 PJ053 基因组DNA 的不完全酶切条件的优化
            2.1.2 PJ053 基因组DNA 片段与pUC19 的连接、转化与筛选
            2.1.3 阳性克隆的酶切鉴定
            2.1.4 阳性克隆的序列测定
        2.2 两株阳性克隆质粒中插入片段的软件分析
            2.2.1 pUCW402 中插入片段的 GenSCAN 软件分析
            2.2.2 pUCW402 中插入片段的 BLAST 分析
            2.2.3 pUCW331 中插入片段的 GenSCAN 软件分析
            2.2.4 pUCW331 中插入片段的 BLAST 分析
            2.2.5 23DHBD 基因的多态性分析
        2.3 23DHBD 基因和HP CD 基因的克隆及鉴定
            2.3.1 23DHBD 基因在 PJ053 基因组 DNA 上的定位
            2.3.2 23DHBD 基因和H PCD 基因的PCR 亚克隆
        2.4 23DHBD 基因和HP CD 基因在不同菌株中的表达
            2.4.1 23DHBD 基因和H PCD 基因的原核表达
            2.4.2 23DHBD 和 HPCD 的蛋白纯化
            2.4.3 23DHBD 和HPCD 抗体的制备及 ELASE 检测
            2.4.4 基因工程菌和PJ053中23DHBD 和HPCD 表达情况的Western 检测
        2.5 不同菌株中23DHBD 酶活分析
            2.5.1 最适温度和最适pH 的确定
            2.5.2 不同底物条件下酶活的测定
    3. 讨论
        3.1 PJ053 基因组文库构建
        3.2 23DHBD 和HPCD 的解析
        3.3 基因工程菌株与野生菌株比较
        3.4 PJ053 菌株中芳香族化合物降解途径解析
第三章 咔唑降解基因簇中carB 基因的克隆与表达
    1. 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 实验仪器
        1.3 实验方法
            1.3.1 CarB 基因的克隆与鉴定
            1.3.2 BL21(pETW-JS1) 和BL21(pETW-JH2) 蛋白诱导表达
    2. 结果
        2.1 咔唑降解途径中carB 基因的克隆及鉴定
        2.2 carB 基因序列的序列分析
        2.3 carB 基因的表达
    3. 讨论
结论
    1 .对四个土壤样品的菌种进行富集培养, 筛选到12株咔唑降解菌株
    2 .节杆菌 PJ053 形态 、生长条件及进化分析结果
    3 .构建了节杆菌PJ053基因组文库并获得两株阳性克隆
    4 . 首次在节杆菌 PJ053中发现了23DHBD 基因
    5 .亚克隆23 DHBD和 HPCD基因并构建了蛋白高效表达的基因工程菌
    6 .对23DHBD和HPCD进行蛋白表达 、 纯化并制备多克隆抗体 。基因工程菌株与野生型菌株 PJ053表达23DHBD和HPCD蛋白的水平进行了 Western Blotting检 测
    7 .从JS061和JH062菌株中克隆了CarB基 因
参考文献
附录
致 谢
在学期间公开发表论文及著作情况



本文编号：3790276