Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解基因表达调控研究

发布时间：2023-05-19 01:34

　　Delftia tsuruhatensis AD9能以苯胺或邻苯二酚为唯一碳源和氮源进行生长。与目前已报道的其它苯胺降解菌比较,该菌表现出较高的苯胺降解速率和较强的苯胺耐受能力。本研究采用基因敲除、lacZ融合表达、凝胶阻滞实验以及荧光定量PCR等方法,开展了D. tsuruhatensis AD9苯胺降解调控蛋白TadR的功能鉴定和tad基因簇表达调控机制研究。 D. tsuruhatensis AD9苯胺降解基因簇组成结构分析表明,苯胺降解基因分布在三个操纵子。氨基酸序列分析表明,D. tsuruhatensis AD9的TadR属于LysR-type家族的调控蛋白,与苯胺降解菌Pseudomonas putida UCC22的TdnR有97.6%的同源性;OrfS同样属于LysR-type家族调控蛋白,与苯酚降解菌Comamonas testosteroni TA441的AphT氨基酸序列有69%的同源性。苯胺降解基因簇结构基因的表达可能受到这两个LysR-type蛋白的调控。 为了验证苯胺降解基因簇的表达调控,本工作构建了tadR的缺失插入突变株。tadR突变株不能以苯胺为唯一...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 微生物中芳香族化合物降解基因簇转录调控的研究进展
    1.1 微生物中苯胺降解基因簇的研究进展
        1.1.1 微生物中苯胺降解基因簇代谢途径的研究
        1.1.2 微生物苯胺降解基因簇的克隆
    1.2 微生物中苯胺代谢表达调控的研究
        1.2.1 基因水平上苯胺降解基因簇的表达调控研究
        1.2.2 蛋白质组水平研究苯胺的代谢调控
        1.2.3 利用代谢工程研究苯胺降解基因簇的表达调控
    1.3 微生物中芳香组化合物降解基因簇转录调控的研究进展
        1.3.1 LysR-type转录调节蛋白
        1.3.2 IclR-type调控蛋白
        1.3.3 AraC-type调控蛋白
        1.3.4 XylR/NtrC-type调控蛋白
        1.3.5 GntR-type调控蛋白
        1.3.6 TetR-, MarM-和FNR-type调控蛋白
        1.3.7 双成分信号家族调控蛋白
        1.3.8 细胞生理水平的高级调控
    1.4 提高芳烃化合物降解能力的策略
        1.4.1 通过代谢工程构建新的降解途径
        1.4.2 利用蛋白质工程提高降解效率
        1.4.3 提高降解菌的环境适应性
        1.4.4 提高污染物的生物可利用度
        1.4.5 生物安全性
    1.5 邻苯二酚2,3-双加氧酶的研究进展
        1.5.1 邻苯二酚2,3-双加氧酶结构
        1.5.2 邻苯二酚2,3-双加氧酶的反应机制
        1.5.3 邻苯二酚2,3-双加氧酶在不同菌属中的功能
        1.5.4 苯胺降解基因簇中邻苯二酚2,3-双加氧酶的功能
    1.6 本论文的立题依据
第二章 LysR-type调控蛋白TadR的功能鉴定
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 酶，试剂和试剂盒
        2.1.3 培养基
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 抗生素
    2.2 方法
        2.2.1 质粒DNA的提取
        2.2.2 基因组DNA提取
        2.2.3 PCR扩增及纯化
        2.2.4 酶切及连接反应
        2.2.5 高效率转化感受态细胞的制备、转化
        2.2.6 重组子的筛选与鉴定
        2.2.7 三亲接合
        2.2.8 苯胺的测定采用偶氮比色法
        2.2.9 β-半乳糖苷酶活性分析
    2.3 结果
        2.3.1 TadR蛋白序列分析
        2.3.2 调控蛋白TadR突变株的构建过程
        2.3.3 tadR互补菌株的构建
        2.3.4 野生型AD9、突变株AD91、互补菌株AD94 的特征及生理生化测定
        2.3.5 tadQ启动子验证载体的构建
        2.3.6 ONPG法定量测定结合子的β-半乳糖苷酶活性
    2.4 讨论
第三章 苯胺降解基因簇tad操纵子的分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 酶，试剂及主要仪器
        3.1.3 培养基与抗生素
        3.1.4 引物
    3.2 方法
    3.3 结果与分析
        3.3.1 AD9 苯胺降解基因簇中tadD2 的诱导型启动子的预测
        3.3.2 tadD2 启动子验证载体的构建
        3.3.3 tadD2 启动子的活性和诱导谱分析
        3.3.4 tadD2 启动子结构分析
        3.3.5 tadQ启动子的诱导谱分析
        3.3.6 tadQ启动子结构分析
        3.3.7 OrfS的结构分析
        3.3.8 OrfS的系谱分析
    3.4 讨论
第四章 TadR调控蛋白在苯胺降解基因簇中的功能研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 酶，试剂，试剂盒及主要仪器
        4.1.3 培养基与抗生素
        4.1.4 PCR引物
        4.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用溶液及缓冲液
        4.1.6 纯化His-Tag融合蛋白的NTA缓冲液的配制
        4.1.7 凝胶阻滞试剂配置
    4.2 原理
        4.2.1 凝胶阻滞实验原理
        4.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)原理
    4.3 方法
        4.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳操作
        4.3.2 融合蛋白的诱导表达
        4.3.3 蛋白表达形式的分析
        4.3.4 TadR-His融合蛋白的纯化
        4.3.5 总蛋白的测定
        4.3.6 凝胶阻滞实验
        4.3.7 反转录样品的处理
        4.3.8 细菌总RNA的提取
        4.3.9 第一链cDNA的反转录合成
        4.3.10 PCR反应体系及反应条件
        4.3.11 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的实验过程
        4.3.12 数据分析
        4.3.13 其它的实验方法
    4.4 结果与分析
        4.4.1 原核表达载体pETR的构建
        4.4.2 融合蛋白TadR的表达与分析
        4.4.3 融合蛋白TadR的纯化与分析
        4.4.4 探针的标记结果
        4.4.5 TadR蛋白与探针的结合实验
        4.4.6 RNA的提取
        4.4.7 RT-PCR鉴定AD9 和AD91 中苯胺降解基因簇中各基因转录的表达
        4.4.8 实时荧光定量PCR验证苯胺降解基因簇基因的表达情况
    4.5 讨论
第五章 AD9 降解氯代苯胺特征及TadC1, TadC2 功能验证
    5.1 材料
        5.1.1 菌株和质粒
        5.1.2 酶，试剂及主要仪器
        5.1.3 培养基与抗生素
        5.1.4 引物
    5.2 方法
        5.2.1 代谢产物的检测
        5.2.2 序列分析及蛋白结构预测
        5.2.3 邻苯二酚含量的测定(p-aminophenol方法)
        5.2.4 邻苯二酚2,3-双加氧酶的测定
    5.3 结果与分析
        5.3.1 AD9 降解特性分析
        5.3.2 tadC1 和tadC2 基因的序列分析及蛋白结构比较
        5.3.3 原核表达载体pETC1 和pETC2 的构建
        5.3.4 原核表达载体pETC1 和pETC2 表达产物的SDS-PAGE分析
        5.3.5 邻苯二酚2,3-双加氧酶在大肠杆菌中的表达
        5.3.6 邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活测定
    5.4 讨论
结论
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3819398