Shinella sp.HZN7代谢尼古丁的分子机制初步研究

发布时间：2024-06-14 06:20

　　尼古丁作为一种有毒的危险废弃物,给人们的生存环境带来了极大威胁,从烟草废弃物中去除尼古丁或者将其转化为有价值的化合物显得尤为重要,而微生物处理方法因其快速、价廉等优点被普遍关注。研究微生物降解尼古丁的机理可为揭示尼古丁代谢的生物化学机制和进一步的实际应用提供理论依据和参考。本论文从杭州农药厂的活性污泥中筛选到一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinellasp.HZN7,并对其生理生化特性进行了研究,结果显示:菌株HZN7在30～35 ℃时降解效率最高;在pH值6.5～8.0之间降解速率变化不大。在温度为30 ℃,pH为7.0的条件下,Shinella sp.HZN7能在3小时内将浓度为500mg/L的尼古丁完全降解。然后研究了该菌株的代谢中间产物,利用紫外光谱仪(UV)、高效液相色谱仪(HPLC)和高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)共检测到五种代谢中间产物,分别为6-羟基尼古丁(6-hydroxy-nicotine,6HN),6-羟基麦斯明(6-hydroxy-N-methylmyosmine,6HMM),6-羟基假氧尼古丁(6-hydroxypseudooxynicotine,6H...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 尼古丁简介
        1.1.1 尼古丁的性质
        1.1.2 尼古丁的来源和用途
    1.2 尼古丁的污染及危害
        1.2.1 尼古丁的污染
        1.2.2 尼古丁对人类的危害
    1.3 微生物降解尼古丁的研究现状
        1.3.1 降解尼古丁的微生物
        1.3.2 尼古丁降解过程中的颜色反应
    1.4 尼古丁的代谢途径及其分子机制
        1.4.1 吡啶途径及其分子机制
        1.4.2 吡咯烷途径及其分子机制
        1.4.3 吡啶和吡咯烷交叉途径
        1.4.4 脱甲基途径
    1.5 尼古丁降解菌的生物技术应用
        1.5.1 尼古丁降解菌降解尼古丁的最佳条件
        1.5.2 尼古丁代谢中间产物应用
    1.6 本研究的目的、意义和主要内容
        1.6.1 研究的目的和意义
        1.6.2 研究的主要内容
第二章 尼古丁降解菌Shinella sp. HZN7的筛选和鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种、试剂和所用仪器
        2.1.2 培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 尼古丁降解菌株的富集、纯化和分离
        2.2.2 菌株的培养特征和生理生化特性的测定
        2.2.3 菌株16S rDNA序列的测定和鉴定
            2.2.3.1 菌株基因组DNA提取
            2.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增
            2.2.3.3 菌株16S rRNA基因PCR产物的回收和T/A克隆
            2.2.3.4 感受态细胞的制备与酶连产物的转化
            2.2.3.5 质粒DNA的提取
            2.2.3.6 16S rRNA序列测定和菌株系统发育地位的确定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 尼古丁降解菌的筛选、分离和纯化
        2.3.2 菌株HZN7的培养特征及生理生化特性
        2.3.3 菌株HZN7的测序结果及系统发育地位的确定
    2.4 本章小结
第三章 Shinella sp. HZN7的降解特性及代谢途径研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株、试剂和所用仪器
        3.1.2 培养基
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌株Shinella sp. HZN7种子液制备
        3.2.2 尼古丁含量测定
        3.2.3 不同pH值下菌株对尼古丁的降解
        3.2.4 不同温度下菌株对尼古丁的降解
        3.2.5 不同接菌量下菌株对尼古丁的降解
        3.2.6 不同初始尼古丁浓度下菌株对尼古丁的降解
        3.2.7 尼古丁及其代谢中间产物的检测方法
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 pH值对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响
        3.3.2 温度对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响
        3.3.3 接种量对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响
        3.3.4 尼古丁初始浓度对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响
        3.3.5 代谢中间产物测定
        3.3.6 Shinella sp. HZN7降解途径推测
    3.4 本章小节
第四章 转座子突变文库的构建与筛选
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株、试剂和仪器
        4.1.2 培养基
    4.2 实验方法
        4.2.1 菌株诱变前培养
        4.2.2 转座子诱变
        4.2.3 转座子突变株的筛选
        4.2.4 失活突变株降解尼古丁的验证
        4.2.5 突变株降解液的检测
    4.3 实验结果与讨论
        4.3.1 菌株HZN7诱变最适条件
        4.3.2 菌株HZN7插入突变效率
        4.3.3 代表性转座子突变株的初步分析
            4.3.3.1 a型突变株
            4.3.3.2 b型突变株
            4.3.3.3 c型突变株
            4.3.3.4 d型突变株
            4.3.3.5 e型突变株
    4.4 本章小结
第五章 降解途径的验证和其中一株突变株缺失基因的克隆及功能分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株、试剂和仪器
        5.1.2 培养基
    5.2 实验方法
        5.2.1 6HN,6HMM、6HPON和HSP的制备
        5.2.2 菌株HZN7及其突变株对各种中间产物的降解
        5.2.3 转座子突变基因的克隆
        5.2.4 克隆序列的测定、组装和分析
        5.2.5 orf2基因的敲除
            5.2.5.1 基因片段的敲除及同源重组片段的构建
            5.2.5.2 构建同源重组载体
            5.2.5.3 基因敲除重组子的获得
            5.2.5.4 orf2基因功能
    5.3 结果与分析
        5.3.1 菌株HZN7及其突变株降解分析
        5.3.2 降解途径的确定
        5.3.3 SEFA-PCR克隆突变株N7-X5突变基因的分析
        5.3.4 基因的敲除与功能互补分析
    5.4 讨论
        5.4.1 降解途径
        5.4.2 突变株的选择
        5.4.3 新代谢产物的预测
    5.5 本章小结
第六章 论文总结
    6.1 研究内容
    6.2 创新点
    6.3 不足与展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间的研究成果
    发表的文章
    专利



本文编号：3994267