基于碳纳米管的庆大霉素免疫分析方法研究

发布时间：2017-06-01 05:07

  本文关键词：基于碳纳米管的庆大霉素免疫分析方法研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：庆大霉素是一类氨基糖苷类抗生素,在临床治疗和动物养殖中有着广泛应用。过量的抗生素使用对人类和环境存在危害。由于环境样本中庆大霉素含量很低,对分析方法灵敏度有较高要求。以酶联免疫分析方法为代表的生物分析方法,具有灵敏度高、检测快速、操作简便等优点,成为环境中污染物快速分析的新方向。本文通过制备的庆大霉素单克隆抗体,初步建立了基于碳纳米管免疫新方法。采用直接化学交联法成功制备了免疫原GEN-BSA和包被原GEN-OVA,紫外扫描鉴定证明反应产物交联成功。用免疫原免疫小鼠,三只小鼠抗庆大霉素血清达到预期抑制要求,选取其中抑制率最高的小鼠进行细胞融合,细胞融合后用间接竞争ELISA方法筛选出6株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞分别为2G5D12、2G5F8、2G5E7、2G5D7、2G5F5G7、2G5F5H7,试验对六株杂交瘤分泌的抗体进行亚型鉴定,结果显示单克隆抗体重链均为IgG 2a型,轻链为K型。选取2G5D12细胞株制备腹水,通过体内诱导法大量制备单克隆抗体,腹水经辛酸-硫酸铵法纯化得到纯化单克隆抗体。对实验条件进行优化,采用抗原抗体最佳工作浓度和最优条件绘制竞争抑制曲线,根据拟合曲线计算得检测限(IC90)为0.026 ng/mL,半数抑制(IC50)为0.095 ng/mL,线性范围(IC80-IC20)为0.042~0.2438 ng/mL。2G5D12单克隆抗体除了对妥布霉素有0.31%的交叉反应率,和链霉素、新霉素、卡那霉素、核糖霉素、阿米卡星的交叉反应率均在0.01%以下。实验回收率范围为74.3~126.8%,变异系数小于13.2%。试验稳定性良好。对环境样本庆大霉素含量进行分析,江苏大学环境水样中庆大霉素含量在0.04~0.1 ng/mL,而土壤中庆大霉素含量中在0.115~0.167 ng/mL。牛奶样品中,庆大霉素含量在0.832~1.075 ng/mL;在动物组织中庆大霉素残留量为1.946~3.577 ng/g,均未超出最高残留限量。合成GEN-HRP,并采用两种方法将二抗偶联碳纳米管;讨论碳纳米管合成产物非特异性结合;优化实验条件后,选取2%BSA作为稀释液,MWCNTs-PEG-GAM作为载体。建立了基于碳纳米管的离心定量方法和过滤定性方法。离心定量法获得庆大霉素抑制曲线,根据拟合曲线计算得检测限(IC90)为0.048 ng/mL,半数抑制(IC50)为0.195 ng/mL,线性范围(IC80~IC20)为0.080~0.512 ng/mL。实验测定四种样品回收率和重复率,回收率范围为60.1~135.4%,变异系数小于18.7%。试验稳定性良好。过滤定性法在0.1 ng/L颜色变浅,1 ng/L颜色消失。对环境样本庆大霉素含量进行分析,江苏大学环境水样中庆大霉素含量在0.07~0.146 ng/mL,而土壤中庆大霉素含量在0.198~0.38ng/g;定性分析6、7、10号水样,结果为阴性,9、11、13号土壤样品为阳性。
【关键词】：庆大霉素 单克隆抗体 免疫分析 碳纳米管 环境残留
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X830
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注释表13-14
• 第一章 绪论14-24
• 1.1 环境中抗生素残留现状14-15
• 1.1.1 抗生素使用现状14
• 1.1.2 环境中抗生素来源与分布14-15
• 1.2 庆大霉素研究现状15-18
• 1.2.1 庆大霉素简介15-16
• 1.2.2 最大残留限量及危害16
• 1.2.3 庆大霉素检测方法16-18
• 1.3 碳纳米管研究现状18-22
• 1.3.1 碳纳米管简介18-19
• 1.3.2 碳纳米管毒性19
• 1.3.3 碳纳米管应用19-22
• 1.4 本文研究目的及内容22-24
• 1.4.1 本文研究目的22
• 1.4.2 本文研究内容22-24
• 第二章 庆大霉素单克隆抗体的制备24-36
• 2.1 试验材料24-27
• 2.1.1 试验动物和细胞24
• 2.1.2 主要试剂24-25
• 2.1.3 仪器及材料25
• 2.1.4 主要溶液配制25-27
• 2.2 试验方法27-31
• 2.2.1 庆大霉素免疫原合成27
• 2.2.2 庆大霉素包被原合成27
• 2.2.3 庆大霉素免疫原和包被原的鉴定27
• 2.2.4 动物免疫27-28
• 2.2.5 免疫结果测定28
• 2.2.6 单克隆抗体的制备28-29
• 2.2.7 细胞融合29-30
• 2.2.8 融合细胞的培养及观察30
• 2.2.9 阳性孔的筛选及亚克隆30
• 2.2.10 单克隆抗体亚型的鉴定30
• 2.2.11 杂交瘤细胞的冻存与复苏30-31
• 2.3 结果与讨论31-34
• 2.3.1 庆大霉素人工抗原的合成及鉴定31-32
• 2.3.2 间接ELISA方法的建立32-33
• 2.3.3 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选33-34
• 2.3.4 单克隆抗体亚型的鉴定34
• 2.3.5 杂交瘤细胞的冻存与复苏34
• 2.4 结论34-36
• 第三章 庆大霉素ELISA方法的建立36-51
• 3.1 试验材料36-38
• 3.1.1 试验试剂36
• 3.1.2 试验仪器36-37
• 3.1.3 主要溶液配制37-38
• 3.2 试验方法38-43
• 3.2.1 腹水的制备38
• 3.2.2 单克隆抗体的纯化38-39
• 3.2.3 抗原，抗体最佳工作浓度测定39
• 3.2.4 ELISA条件的优化39-40
• 3.2.5 竞争抑制曲线的建立40-41
• 3.2.6 交叉反应率的测定41
• 3.2.7 回收率及变异系数的测定41
• 3.2.8 环境中样本采集及处理41-43
• 3.3 实验结果与讨论43-49
• 3.3.1 抗原，抗体最佳工作浓度43
• 3.3.2 ELISA优化43-45
• 3.3.3 竞争抑制曲线45-46
• 3.3.4 交叉反应率46-47
• 3.3.5 回收率及变异系数47-48
• 3.3.6 环境中样本分析48-49
• 3.4 结论49-51
• 第四章 基于碳纳米管庆大霉素免疫方法的建立51-67
• 4.1 试验材料51-53
• 4.1.1 试验试剂51
• 4.1.2 试验仪器51-52
• 4.1.3 主要溶液配制52-53
• 4.2 试验方法53-57
• 4.2.1 GEN-HRP的合成53
• 4.2.2 碳纳米管的羧基化53-54
• 4.2.3 MWCNTs-GAM的合成54
• 4.2.4 MWCNTs-PEG-GAM的合成54-55
• 4.2.5 GEN-HRP的鉴定55
• 4.2.6 MWCNTs-GAM和MWCNTs-PEG-GAM的表征55-56
• 4.2.7 碳纳米管非特异性结合实验56
• 4.2.8 基于碳纳米管免疫新方法的建立56-57
• 4.2.9 回收率的测定57
• 4.2.10 环境中样本采集及处理57
• 4.3 结果与讨论57-65
• 4.3.1 GEN-HRP的合成与鉴定57-58
• 4.3.2 MWCNTs-GAM和MWCNTs-PEG-GAM的合成与鉴定58-59
• 4.3.3 碳纳米管非特异性结合实验59-60
• 4.3.4 基于碳纳米管免疫新方法的建立60-62
• 4.3.5 回收率及变异系数测定62
• 4.3.6 环境中样本分析及方法比较62-65
• 4.4 结论65-67
• 第五章 结论与展望67-69
• 5.1 结论67
• 5.2 不足与展望67-69
• 参考文献69-74
• 致谢74-75
• 在学期间发表的学术论文及其他科研成果75

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