甲醛检测降解基因工程菌的构建

发布时间：2017-06-04 22:18

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【摘要】：甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文合成了乳酸乳球菌偏爱密码子优化的甲醛脱氢酶的基因,并以乳酸乳球菌(L.lactis)为宿主,构建可以表达FADH的基因工程菌L6,并对其表达产物进行了鉴定和初步应用研究。Sphingomonas sp.ACM-3962的甲醛脱氢酶FADH由336个氨基酸残基组成。乳酸乳球菌偏爱GC含量降低的编码密码子,根据Lactococcus lactis subsp.cremoris SK11的2504个编码区、696252个密码子的使用情况统计,选择了丰沛及偏爱密码子进行优化。共替换了246个密码子。密码子优化后,可使FADH在乳酸乳球菌中个表达量提高37.14%。鞘氨醇单胞菌ACM-3962的HOCO降解基因簇,在FADHC和FADHA基因之间,存在着一个正向启动子和一个反向启动子,分别控制着FADHA和FADHC的表达。将该段序列克隆出来,在其上下游分别添加绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白,克隆到大肠杆菌中,检测并验证其功能。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,可以启动FADHA基因表达的启动子,可以在HOCO的诱导下启动,使其下游的蛋白得以表达。将FADH promoter-GFP基因和合成的FADH基因插入到pMG36e载体中,构建重组载体pMG-FADH。在E.coli BL21中扩增、验证后,电击转化进L.lactis ML23中,构建可以表达FADH的基因工程菌L.lactis L6。将培养液放置在有紫外灯照射的暗室中,观察菌液颜色,可见菌液发出绿色荧光,表明在HOCO存在时,FADH promoter可以启动GFP-FADH融合的表达,使L.lactis ML23的菌液在紫外灯下发出绿色荧光。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,在乳酸乳杆菌中也可以启动GFP-FADH融合蛋白的表达。冻干的纯化FADH粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将97%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH相比,冻干酶活损失了超过34.8%,因此表达纯化后的FADH的应用受到较大限制。冻干的纯化乳酸乳球菌粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将99%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH乳酸乳球菌,冻干酶活损失了30%,菌体死亡数量大约为48%,因此将乳酸乳球菌直接冻干使用具有较好的应用前景。使用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,与实验室buffer条件下相比,其酶活大大降低,这是因为自然水体中营养物质匮乏、pH等条件较苛刻造成的。这也表明,利用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,还需进行深入研究。在空气中含有100PPM的甲醛时,可诱导乳酸乳球菌中的绿色荧光蛋白进行表达,其荧光强度与菌体量呈线性关系。空气中含有20ppm的甲醛时,绿色荧光蛋白就开始表达,60ppm以上时,绿色荧光强度可定量检测。制备的滤纸片甲醛检测生物传感器,可对环境中的甲醛进行响应,在紫外灯下观察到明显的绿色荧光。构建的乳酸乳球菌基因工程菌,可以对空气环境中甲醛进行响应,从而起到检测空气中甲醛的作用,可以作为空气中甲醛检测生物传感器使用。
【关键词】：甲醛降解 甲醛脱氢酶 乳酸乳球菌
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;Q78
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 室内甲醛污染的来源12-13
• 1.1.1 建筑和装饰材料12-13
• 1.1.2 烟叶的不完全燃烧13
• 1.1.3 食物13
• 1.1.4 室外13
• 1.2 甲醛的污染治理方法13-17
• 1.2.1 通风换气式法14
• 1.2.2 控制温湿度法14
• 1.2.3 物理吸附法14
• 1.2.4 化学法14-16
• 1.2.5 生物法16-17
• 1.3 甲醛在微生物中的代谢途径17-20
• 1.3.1 甲醛代谢的同化途径17-19
• 1.3.2 甲醛代谢的异化途径19-20
• 1.4 国内外研究现状20-21
• 1.5 本研究的目的意义21-22
• 第二章 材料和方法22-36
• 2.1 实验中用到的试剂23-24
• 2.2 实验中用到的仪器24
• 2.3 寡核苷酸的溶解24-25
• 2.4 基因合成的两步法25-27
• 2.4.1 DA-PCR25-26
• 2.4.2 OE-PCR26-27
• 2.4.3 T7核酸内切酶I处理27
• 2.5 载体构建与测序27-31
• 2.5.1 质粒提取27-28
• 2.5.2 限制性内切酶消化28
• 2.5.3 重组载体的连接28-29
• 2.5.4 重组载体的热激转化29-30
• 2.5.5 阳性克隆的菌落PCR法鉴定30-31
• 2.6 外源蛋白的表达与活性测定31-32
• 2.6.1 外源基因的诱导表达31
• 2.6.2 FADH活性测定31-32
• 2.7 培养条件对外源蛋白表达的影响32-33
• 2.7.1 蛋白胨对外源蛋白表达的影响32
• 2.7.2 葡萄糖对外源蛋白表达的影响32
• 2.7.3 HOCO浓度对外源蛋白表达的影响32
• 2.7.4 诱导时间对外源蛋白表达的影响32
• 2.7.5 培养温度对外源蛋白表达的影响32
• 2.7.6 菌体密度对外源蛋白表达的影响32-33
• 2.7.7 pH对外源蛋白表达的影响33
• 2.8 NI~(2+)柱亲和层析纯化外源蛋白33-34
• 2.8.1 Ni~(2+)柱亲和层析纯化外源蛋白33
• 2.8.2 表达外源蛋白的SDS-PAGE检测33-34
• 2.8.3 Folin-酚法测定蛋白34
• 2.9 水环境中的甲醛降解实验34-35
• 2.9.1 纯化FADH对水环境中的甲醛降解实验34
• 2.9.2 冻干乳酸乳球菌对水环境中的甲醛降解实验34
• 2.9.3 构建乳酸乳球工程菌在自然水体中生长及甲醛降解实验34-35
• 2.10 空气环境中的甲醛降解实验35
• 2.11 滤纸片甲醛检测生物传感器的制备35-36
• 第三章 结果与讨论36-67
• 3.1 L.LACTIS偏爱密码子编码的FADH基因合成36-47
• 3.1.1 鞘氨醇单胞菌ACM-3962的FADH氨基酸序列36
• 3.1.2 逆编码所用乳酸乳球菌密码子频率表36-38
• 3.1.3 L.lactis偏爱密码子编码的FADH基因38
• 3.1.4 拟合成序列全长38
• 3.1.5 单链寡核苷酸的拆分38-40
• 3.1.6 化学合成寡核苷酸的溶解与混合40-43
• 3.1.7 两步法合成结果43-45
• 3.1.8 亚克隆载体构建与测序45-47
• 3.2 FADH启动子的合成与功能验证47-55
• 3.2.1 拟合成序列全长47
• 3.2.2 单链寡核苷酸的拆分47-49
• 3.2.3 化学合成寡核苷酸的溶解与混合49-51
• 3.2.4 两步法合成结果51-52
• 3.2.5 功能验证载体构建与测序52-53
• 3.2.6 FADH启动子功能验证53-55
• 3.3 乳酸乳球菌表达载体构建55-57
• 3.3.1 乳酸乳球菌表达载体pMG-FADH的构建55
• 3.3.2 重组子的菌落PCR鉴定55-56
• 3.3.3 重组载体pMG-FADH的诱导表达56-57
• 3.4 培养条件对FADH表达的影响57-60
• 3.4.1 蛋白胨对FADH表达的影响57
• 3.4.2 葡萄糖对FADH表达的影响57-58
• 3.4.3 HOCO浓度对FADH表达量的影响58
• 3.4.4 诱导时间对FADH表达量的影响58
• 3.4.5 培养温度对FADH表达量的影响58-59
• 3.4.6 菌体密度对FADH表达的影响59
• 3.4.7 pH对FADH表达的影响59
• 3.4.8 最适发酵工艺条件下的FADH表达59-60
• 3.5 NI~(2+)柱亲和层析纯化FADH60-62
• 3.5.1 Folin-酚法测定总蛋白质含量60-61
• 3.5.2 Ni~(2+)柱亲和层析纯化FADH61-62
• 3.6 水环境中的甲醛降解实验62-64
• 3.6.1 纯化FADH对水环境中的甲醛降解实验62-63
• 3.6.2 冻干乳酸乳球菌对水环境中的甲醛降解实验63
• 3.6.3 构建乳酸乳球工程菌在自然水体中生长及甲醛降解实验63-64
• 3.7 空气环境中的甲醛降解实验64-66
• 3.8 滤纸片甲醛检测生物传感器的制备66-67
• 第四章 结论67-70
• 参考文献70-74
• 致谢74

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本文编号：422300