菲律宾蛤仔无机砷甲基转化及其分子机制的研究

发布时间：2017-07-08 05:13

  本文关键词：菲律宾蛤仔无机砷甲基转化及其分子机制的研究

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【摘要】：砷是自然界广泛分布的有毒类金属,水体中砷主要以毒性很高的无机砷形式存在。本论文针对我国近海砷污染现状,以近岸广泛分布的海洋环境监测生物菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)为研究对象,采用砷酸盐(AsⅤ)和亚砷酸盐(AsⅢ)进行毒性暴露,利用分析化学、分子生物学、生物化学等技术手段研究菲律宾蛤仔对无机砷的富集转化规律,探讨谷胱甘肽-S-转移酶Ω(GSTΩ)在菲律宾蛤仔砷代谢过程中的功能机制,并揭示砷暴露下菲律宾蛤仔的组织病理变化,从而为阐明海洋贝类对无机砷的富集转化规律及其分子机制提供一定依据,同时也可为贝类安全养殖和食用提供理论依据。主要研究结果如下:(1)菲律宾蛤仔对无机砷生物利用率低,对As(Ⅲ)生物利用率高于As(Ⅴ)。菲律宾蛤仔组织中无机砷的转化过程可能既包括As(Ⅴ)还原和甲基转化,还存在As(Ⅲ)氧化。菲律宾蛤仔肝胰腺和鳃组织对无机砷富集转化存在差异,砷更易于在肝胰腺中富集。砷甜菜碱(AsB)和二甲基胂酸盐(DMA)是组织中主要的砷形态,在肝胰腺中无机砷主要转化为AsB,而鳃组织中无机砷主要转化为DMA。各处理组中金属硫蛋白样蛋白(MTLP)是砷在亚细胞水平的主要结合位点,其次是细胞碎片。金属敏感组分(MSF)中总砷变化较为明显,而生物解毒金属组分(BDM)中总砷含量变化较小,且与肝胰腺相比,鳃组织对砷的解毒能力有限。(2)克隆获得了菲律宾蛤仔体内无机砷甲基化关键酶GSTΩ基因,并对其进行了体外重组表达。GSTΩ重组蛋白具有砷酸盐还原酶活性,且在底物浓度较高,低pH和常温(37℃)条件下活性较高。将GSTΩ转化到砷敏感菌株E.coli AW3110(DE3)(ΔarsRBC)后,能够提高该菌株对无机砷的耐受性,表明其在无机砷的转化和解毒方面发挥了重要作用。(3)分别从转录水平和蛋白水平检测了GSTΩ在无机砷暴露后的表达变化情况以及砷酸盐还原酶活性的改变。结果发现多个处理组菲律宾蛤仔肝胰腺和鳃组织GSTΩ相对表达量增加,砷酸盐还原酶活性升高,进一步表明其可能在菲律宾蛤仔无机砷甲基转化和解毒过程中发挥了重要作用。采用免疫组化方法对GSTΩ在组织中的表达进行定位,结果表明GSTΩ蛋白主要在鳃丝上皮细胞以及鳃腔中的血细胞中表达,在消化腔内壁上皮细胞中表达。(4)不同浓度无机砷暴露一定时期后,菲律宾蛤仔体内GSH含量、GR、GST活性在多个处理组出现活性的显著升高,表明砷暴露会引发机体内抗氧化应激反应。随着暴露时间的增加,在菲律宾蛤仔鳃、肝胰腺、外套膜均已产生不同程度的病理损伤,在100μg/L As(Ⅲ)暴露30天时肝胰腺出现消化管坏死的现象,肌肉纤维也出现断裂扭曲;鳃丝上皮细胞溶解,出现大量空泡;外套膜内表皮和外表皮均出现严重损伤。As(Ⅲ)暴露造成的损伤程度高于As(Ⅴ),证实As(Ⅲ)毒性强于As(Ⅴ)的结论。
【关键词】：菲律宾蛤仔 砷 富集 转化 亚细胞分布 GSTΩ 病理变化
【学位授予单位】：中国科学院烟台海岸带研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X55;S917.4
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-17
• 缩略词17-19
• 1 引言19-33
• 1.1 砷概况19-23
• 1.1.1 砷的来源19
• 1.1.2 砷的形态及毒性19-20
• 1.1.3 砷的生物毒性效应20-21
• 1.1.3.1 砷的毒性作用机制20
• 1.1.3.2 砷对人和动物的毒性效应20-21
• 1.1.3.3 砷对植物的毒性效应21
• 1.1.4 我国水体砷污染现状21-23
• 1.2 砷的代谢23-28
• 1.2.1 砷的吸收23-24
• 1.2.2 砷的甲基转化24-28
• 1.2.2.1 砷甲基化相关酶类24-25
• 1.2.2.2 无机砷甲基转化研究进展25-28
• 1.2.3 砷的排出28
• 1.3 重金属在水生生物中的累积28-30
• 1.3.1 重金属的生物累积特征28-29
• 1.3.2 重金属生物累积的亚细胞分布29-30
• 1.4 抗氧化酶系的应答在生态毒理学中的应用30-32
• 1.5 组织病理分析在海洋生态毒理学中的应用32-33
• 2 本论文的研究内容、意义及技术路线33-35
• 2.1 研究内容与意义33-34
• 2.2 技术路线34-35
• 3 菲律宾蛤仔组织中砷的富集转化和亚细胞分布35-48
• 3.1 实验材料35-37
• 3.1.1 实验动物35-36
• 3.1.2 实验试剂36
• 3.1.3 实验仪器36-37
• 3.2 实验方法37-38
• 3.2.1 菲律宾蛤仔肝胰腺与鳃组织中总砷含量测定37
• 3.2.2 菲律宾蛤仔肝胰腺与鳃组织不同赋存形态砷含量分析37-38
• 3.2.3 亚细胞组分分布38
• 3.2.4 数据统计分析38
• 3.3 实验结果38-44
• 3.3.1 肝胰腺和鳃组织中总砷的富集38-40
• 3.3.2 肝胰腺和鳃组织中不同赋存形态砷的含量40-42
• 3.3.3 肝胰腺和鳃组织中总砷的亚细胞分布42-44
• 3.4 讨论44-47
• 3.4.1 肝胰腺和鳃组织中总砷的富集44-45
• 3.4.2 肝胰腺和鳃组织中不同赋存形态砷的含量45-46
• 3.4.3 肝胰腺和鳃组织中总砷的亚细胞分布46-47
• 3.5 小结47-48
• 4 无机砷甲基化关键酶GSTΩ 基因的重组表达及功能验证48-67
• 4.1 实验材料49-52
• 4.1.1 实验样品49
• 4.1.2 实验试剂49-51
• 4.1.3 实验仪器51-52
• 4.2 实验方法52-61
• 4.2.1 无机砷甲基化关键酶GSTΩ 基因的扩增与原核表达52-58
• 4.2.1.1 菲律宾蛤仔总RNA的提取及cDNA的合成52-53
• 4.2.1.2 砷甲基化关键酶GSTΩ 基因的扩增与克隆53-54
• 4.2.1.3 GSTΩ 重组片段转化表达菌BL21(DE3)与检测54-56
• 4.2.1.4 重组GSTΩ 蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及其抗体的Western blot检测56-58
• 4.2.2 GSTΩ 基因重组蛋白的活性检测58-59
• 4.2.3 GSTΩ 重组片段在大肠杆菌突变体Escherichia coli AW3110(DE3)中的功能验证59-61
• 4.3 实验结果61-63
• 4.3.1 GSTΩ 基因的重组表达61-62
• 4.3.2 重组GSTΩ 蛋白的活性检测62-63
• 4.3.3 砷超敏感菌株中验证GSTΩ 基因的功能63
• 4.4 讨论63-65
• 4.4.1 无机砷甲基化关键酶GSTΩ 基因的扩增与原核表达63-64
• 4.4.2 重组GSTΩ 蛋白的活性检测64
• 4.4.3 砷超敏感菌株中验证GSTΩ 基因的功能64-65
• 4.5 小结65-67
• 5 砷甲基化关键基因GSTΩ 对无机砷胁迫的分子响应67-81
• 5.1 实验材料67-69
• 5.1.1 实验动物67-68
• 5.1.2 实验试剂68-69
• 5.1.3 实验仪器69
• 5.2 实验方法69-73
• 5.2.1 实时定量PCR检测无机砷暴露后组织中GSTΩ 转录水平表达量变化69-70
• 5.2.2 无机砷暴露后组织中GSTΩ 蛋白表达分布检测70-72
• 5.2.3 无机砷暴露后组织中GSTΩ 酶活力变化72-73
• 5.2.4 数据统计分析73
• 5.3 实验结果73-77
• 5.3.1 无机砷暴露后GSTΩ 转录水平表达量变化73-75
• 5.3.2 无机砷暴露后组织中GSTΩ 蛋白表达分布变化75-77
• 5.3.3 无机砷暴露后组织中GSTΩ 酶活力变化77
• 5.4 讨论77-80
• 5.4.1 无机砷暴露后GSTΩ 转录水平表达量变化77-79
• 5.4.2 无机砷暴露后组织中GSTΩ 蛋白表达分布变化79
• 5.4.3 无机砷暴露后组织中GSTΩ 酶活力变化79-80
• 5.5 小结80-81
• 6 无机砷暴露后菲律宾蛤仔的病理生理响应81-95
• 6.1 实验材料81-83
• 6.1.1 实验动物81-82
• 6.1.2 实验试剂82
• 6.1.3 实验仪器82-83
• 6.2 实验方法83-84
• 6.2.1 砷暴露下菲律宾蛤仔体内抗氧化防御系统的测定83
• 6.2.2 砷暴露下菲律宾蛤仔的组织病理变化83-84
• 6.3 实验结果84-91
• 6.3.1 无机砷暴露后不同组织GSH含量、GR和总GST活力变化84-87
• 6.3.2 砷暴露下菲律宾蛤仔的组织病理变化87-91
• 6.4 讨论91-94
• 6.4.1 无机砷暴露后不同组织GSH含量、GR和总GST活力变化91-93
• 6.4.2 砷暴露下菲律宾蛤仔的组织病理变化93-94
• 6.5 小结94-95
• 7 结论与研究展望95-97
• 7.1 本研究的主要结论95
• 7.2 本研究的主要创新点95-96
• 7.3 需进一步解决的问题96-97
• 参考文献97-119
• 作者简介119-120
• 硕士期间发表论文120

【参考文献】

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本文编号：533160