Acinetobacter sp.Y1的氨氮去除性能及其关键酶的研究

发布时间：2017-08-12 16:04

  本文关键词：Acinetobacter sp.Y1的氨氮去除性能及其关键酶的研究

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【摘要】：Acinetobacter sp.Y1是一株从太原焦化废水处理厂中筛选到的异养硝化好氧反硝化细菌。本实验对Acinetobacter sp.Y1进行了氨氮和COD去除性能检测,氨氮去除路径中关键酶-羟胺氧化还原酶(HAO)、亚硝酸盐还原酶(NIR)和硝酸盐还原酶(NAR)的酶活性检测,HAO的分离纯化和酶学性质研究,并对全基因组进行测序和分析,得到的主要结论如下:1.柠檬酸钠为碳源、硫酸铵为氮源,培养24 h,Acinetobacter sp.Y1对氨氮、总氮、COD的去除率分别达到98%、94%、92%。硝化过程中羟胺、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮不积累。2.优化超声波破碎法提取粗酶的工作条件,得到最佳参数组合为:破碎功率50 W,工作与间歇时间分别为4 s和7 s,菌液密度1.250,总工作时间20 min。检测到HAO、NIR、NAR的比活力分别为0.011、0.002、0.018 U/mg protein。HAO是周质蛋白,SDS-PAGE分析比较渗透压休克法和超声波破碎法得到的粗酶液,发现渗透压休克法得到的粗酶液杂蛋白种类少,含量低,HAO酶活性高,比超声波破碎法更适合用来提取HAO。3.优化培养条件,得到柠檬酸钠为碳源、硫酸铵为氮源、C/N=14、培养时间16 h时,HAO产量最高。渗透压休克法提取粗酶后,采用DEAE SefinoseTM FF离子交换层析和SefinoseTM CL-6B凝胶过滤层析对粗酶液进行分离纯化,首次纯化得到分子量为47 k Da的HAO,纯化倍数为7.32,产率为19.40%。酶学性质研究发现:HAO反应的最适p H为8.0,最适温度为30 oC,在p H 7-8,温度低于30 o C时相对稳定;1 mmol/L的Mg~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Ag~+、Pb~(2+)、Na~+和K~+对HAO酶活性有促进作用,Mn~(2+)、Zn~(2+)对HAO影响不大,Cu~(2+)、Ca~(2+)、Ba~(2+)对其有抑制作用;0.4 mmol/L EDTA-2Na促进HAO酶活性,但抑制作用随EDTA-2Na浓度增加而增大;细胞色素C不能代替K3[Fe(CN)6]作为HAO的电子受体。4.采用全基因组鸟枪法对Acinetobacter sp.Y1的全基因组进行测序。得到的组装尺寸为3384069 bp,分为24个scaffold,平均GC含量39.56%。RAST注释得到蛋白编码基因3137个,总编码长度2957373 bp,编码比率87.39%。5.测序结果与公共数据库比对,注释上PFAM、NR、CDD、Swiss-Prot、COG、Tr EMBL、GO、KEGG等数据库对应的基因。对预测基因进行COG功能分类预测,共有2295个基因被注释上20种COG分类;GO功能分类预测,共有2113个基因注释上功能分类,在生物学过程分类中注释最多的是细胞过程和代谢过程;在细胞学组件分类中注释最多的是细胞和细胞成分;在分子功能分类中注释最多的是结合活性和催化活性。KEGG注释结果显示,1708个基因共注释上167条路径,含氮代谢和多条污染物代谢路径。并比对上glt B、glt D、nas A、nir B、NRT、GLUD1_2、gud B、cyn T、ncd2、nrt C、gln A、gdh A、nrt B、amo等多条与氮代谢相关的基因序列,为Acinetobacter sp.Y1氨氮去除路径的研究提供理论依据。6.此外,Acinetabacter sp.Y1不仅能去除污水中的氨氮,还能降解乙苯、苯乙烯、萘、柠檬烯和蒎烯、环氯乙烷和氯苯、氨基苯甲酸、硝基甲苯、多环芳烃、苯酸盐、双酚、香叶醇、二恶英等,在污染治理领域具有巨大的应用潜能。
【关键词】：异养硝化 氨氮 羟胺氧化还原酶 亚硝酸盐还原酶 硝酸盐还原酶 基因组测序
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X784
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 绪论13-31
• 1.1 氮素污染现状13-16
• 1.1.1 水体氮素来源13
• 1.1.2 水体中氮素的危害13-14
• 1.1.3 废水排放标准14-16
• 1.2 废水脱氮技术16-19
• 1.2.1 化学脱氮法16
• 1.2.2 物理化学脱氮法16
• 1.2.3 生物脱氮法16-19
• 1.3 异养硝化19-21
• 1.3.1 异养硝化细菌19
• 1.3.2 异养硝化过程中的关键酶19-21
• 1.4 好氧反硝化21-22
• 1.4.1 好氧反硝化过程21
• 1.4.2 好氧反硝化过程中的关键酶21-22
• 1.5 异养硝化好氧反硝化22-24
• 1.5.1 异养硝化好氧反硝化技术22-23
• 1.5.2 异养硝化好氧反硝化路径23-24
• 1.6 微生物基因组学研究24-28
• 1.6.1 微生物基因组学研究的现状24-26
• 1.6.2 微生物基因组学研究的应用26
• 1.6.3 Acinetobacter属基因组学研究的现状26-28
• 1.7 课题研究的来源、背景意义与内容28-31
• 1.7.1 课题研究的来源28
• 1.7.2 课题研究的背景意义28-29
• 1.7.3 课题研究的内容29
• 1.7.4 课题研究的技术路线29-31
• 第二章 Acinetobacter sp. Y1的氨氮去除性能及关键酶活性31-41
• 2.1 引言31
• 2.2 实验材料与仪器31-32
• 2.2.1 菌株及培养基31-32
• 2.2.2 实验试剂32
• 2.2.3 实验仪器32
• 2.3 实验方法32-34
• 2.3.1 氨氮去除性能32-33
• 2.3.2 超声波破碎法提取粗酶的条件优化33
• 2.3.3 渗透压休克法提取HAO33
• 2.3.4 HAO、NIR、NAR酶活性测试33
• 2.3.5 分析方法33-34
• 2.4 结果与分析34-40
• 2.4.1 标准曲线34-35
• 2.4.2 氨氮及COD去除性能35-36
• 2.4.3 超声波破碎法粗酶提取条件优化36-38
• 2.4.4 两种HAO提取方法的比较38-39
• 2.4.5 HAO、NIR、NAR酶活性测试39-40
• 2.5 本章小结40-41
• 第三章 HAO的优化、纯化和酶学性质研究41-57
• 3.1 引言41
• 3.2 实验材料与仪器41-42
• 3.2.1 实验试剂41
• 3.2.2 实验仪器41-42
• 3.3 实验方法42-47
• 3.3.1 产酶条件优化42
• 3.3.2 HAO分离纯化42-46
• 3.3.3 HAO酶学性质研究46-47
• 3.4 结果与分析47-55
• 3.4.1 产酶条件优化47-48
• 3.4.2 HAO分离纯化48-52
• 3.4.3 HAO酶学性质研究52-55
• 3.5 本章小结55-57
• 第四章 Acinetobacter sp. Y1全基因组测序及分析57-75
• 4.1 引言57
• 4.2 实验材料与方法57-60
• 4.2.1 菌株及培养基57
• 4.2.2 实验仪器57
• 4.2.3 测序样品的准备57-58
• 4.2.4 基因组测序58
• 4.2.5 软件及数据库58-59
• 4.2.6 原始数据处理59
• 4.2.7 基因组拼接59
• 4.2.8 同源基因组比对59
• 4.2.9 基因预测59
• 4.2.10与公共数据库比对59-60
• 4.2.11 COG注释60
• 4.2.12 GO注释60
• 4.2.13 Pathway注释60
• 4.3 结果与分析60-73
• 4.3.1 测序结果概况60-62
• 4.3.2 同源基因组比较62-63
• 4.3.3 基因预测63-64
• 4.3.4 与公共数据库比对64-66
• 4.3.5 COG注释66-68
• 4.3.6 GO注释68-69
• 4.3.7 Pathway注释69-71
• 4.3.8 氨单加氧酶71-73
• 4.4 本章小结73-75
• 第五章 主要结论与展望75-77
• 5.1 主要结论75-76
• 5.2 展望76-77
• 参考文献77-87
• 致谢87-89
• 攻读学位期间学术成果及奖励89

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本文编号：662417