高产赤霉素菌株选育及发酵工艺优化
发布时间：2020-12-17 20:31
赤霉素（Gibberellin acid,GA3）是由藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）发酵产生的一类具有促进植物种子萌发及根、茎生长作用等作用的植物激素,被广泛的应用于农、林、园艺、食品酿造等诸多领域,市场潜力巨大。我国虽有众多厂家生产,但多年发酵水平停滞在1 800 mg/L左右,生产成本偏高制约其应用。本研究将围绕如何提高GA3的产量和质量,在菌种筛选、发酵工艺优化、代谢途径分析、发酵过程建模及补料策略优化和吸附耦合发酵等方面进行较为系统的研究,以期降低生产成本,扩大GA3在相关领域的应用,促进产业发展。具体研究结果如下：1.GA3高产菌株定向筛选以工业生产菌株Gibberella fujikuroi 978#为出发株,针对不产孢、不产色素的多核丝状菌的特性,开展了以生化推理选育（采用脂肪酶活性为初筛指标）以及耐抑真菌剂（制霉菌素或特比萘芬）的抗性GA3高产菌株筛选。对出发菌株菌丝机械断裂获得单细胞悬液后,紫外诱变处理,筛选出4株产赤霉素效价高于出发菌株的突变株,其中菌株GL-2在优化豆油补加工艺后,发酵产赤霉素是菌株978#的1.364倍。抗性筛选中,对菌悬...
【文章来源】：中南林业科技大学湖南省
【文章页数】：179 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 赤霉素化学结构与生物活性
1.1.1 赤霉素化学结构
3生物活性"> 1.1.2 赤霉素GA3生物活性
1.2 赤霉素生产菌株遗传特性及研究现状
1.2.1 赤霉素生产菌株研究进展
1.2.2 赤霉菌合成赤霉素分子机理
1.3 高产菌株诱变与筛选
1.3.1 诱变育种方法
1.3.2 常用筛选技术
1.3.3 赤霉素高产菌株筛选
1.4 赤霉素发酵现状与优化策略
1.4.1 培养基各组分对发酵影响
1.4.2 发酵培养环境条件确立
1.4.3 赤霉素发酵动力学研究
1.4.4 赤霉素流加补料发酵
1.4.5 赤霉素代谢网络分析
1.4.6 发酵前体筛选
1.4.7 提取分离耦合发酵技术
1.5 赤霉菌产赤霉素机理解析对其他产物合成的意义
1.5.1 作为紫杉醇合成基因改造的宿主菌
1.5.2 作为生物转化制备药物中间体
1.5.3 作为调节其他途径产物因素
1.6 本研究目的与意义
3菌株定向高效选育">第二章 高产GA3菌株定向高效选育
2.1 前言
2.1.1 赤霉素生产菌株现状与保藏
2.1.2 高产菌株诱变
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株
2.2.2 培养基
2.2.3 培养方法
2.2.4 诱变处理
2.2.5 突变株筛选
2.2.6 菌株遗传稳定性
2.2.7 分析检测方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 赤霉素菌丝断裂效果
2.3.2 产脂肪酶突变株的选育
2.3.3 利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产菌株
2.3.4 特比萘芬抗性筛选赤霉素高产菌株
2.3.5 菌株ZNL13-3发酵特性研究
2.4 结论
3摇瓶发酵条件研究">第三章 赤霉素GA3摇瓶发酵条件研究
3.1 前言
3发酵影响"> 3.1.1 营养条件及种子对GA3发酵影响
3发酵影响"> 3.1.2 温度、pH对GA3发酵影响
3分批发酵影响"> 3.1.3 溶氧DO对GA3分批发酵影响
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株
3.2.2 培养基
3.2.3 培养方法
3.2.4 分析方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 种子生长及种龄的确定
3摇瓶发酵过程的影响"> 3.3.2 环境条件对GA3摇瓶发酵过程的影响
3发酵过程的影响"> 3.3.3 营养条件对GA3发酵过程的影响
3合成摇瓶发酵过程分析"> 3.3.4 GA3合成摇瓶发酵过程分析
3.3.5 不同pH值控制对发酵过程的影响
3分批发酵影响"> 3.3.6 温度对GA3分批发酵影响
3发酵影响"> 3.3.7 溶氧DO值对GA3发酵影响
3发酵的影响"> 3.3.8 发酵环境对赤霉素GA3发酵的影响
3.4 结论
3合成代谢网络分析与前体筛选">第四章 GA3合成代谢网络分析与前体筛选
4.1 前言
4.1.1 代谢控制分析-揭示细胞代谢的动态变化规律
4.1.2 系统代谢流控制机制
4.1.3 代谢工程基本原理和萜类代谢工程进展
4.1.4 赤霉素代谢网络构建
4.2 试剂与方法
4.2.1 菌株及药品
4.2.2 培养基与培养方法
4.2.3 分析方法
4.2.4 代谢过程及通量分析
4.2.5 前体促进剂筛选实验设计
4.3 结果及讨论
4.3.1 静息培养赤霉菌菌龄筛选
4.3.2 固定化菌丝静息流化产素研究
3合成代谢网络的构建"> 4.3.3 GA3合成代谢网络的构建
3代谢网络通量计算"> 4.3.4 GA3代谢网络通量计算
3合成极限得率"> 4.3.5 代谢网络推测GA3合成极限得率
4.3.6 最优前体促进剂组成
4.4 结论
3发酵过程建模与控制策略">第五章 GA3发酵过程建模与控制策略
5.1 前言
5.1.1 发酵过程建模类型
5.1.2 动力学参数求解
3分批发酵动力学"> 5.1.3 赤霉素GA3分批发酵动力学
5.1.4 发酵过程优化与控制
5.1.5 菌丝形态与发酵生产
5.2 实验与方法
5.2.1 菌株及药品
5.2.2 培养基
5.2.3 实验方法
5.2.4 分析方法
5.3. 结果与讨论
3发酵过程变化"> 5.3.1 赤霉素GA3发酵过程变化
3分批发酵动力学模型"> 5.3.2 GA3分批发酵动力学模型
5.3.3 分批发酵动力学模型的评价
5.3.4 模型模拟优化补料流速
3发酵模型"> 5.3.5 引入菌丝生理状态的GA3发酵模型
5.4 本章小结
3耦合发酵中的应用">第六章 磁性分子印迹微球构建及在GA3耦合发酵中的应用
6.1 前言
6.1.1 耦合发酵技术
6.1.2 磁性分子印迹载体
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株与材料
6.2.2 实验方法
6.2.3 磁性分子印迹载体制备
6.2.4 印迹微球的吸附性能研究及其表征
6.2.5 MMIPs耦合发酵
6.2.6 分析方法
6.3 结果与讨论
6.3.1 大孔树脂静态筛选
6.3.2 树脂D-100添加工艺单因素分析
6.3.3 中心组合方法优化耦合发酵工艺
3分子印迹微球MMIPs的表征"> 6.3.4 磁性GA3分子印迹微球MMIPs的表征
6.3.5 分子印迹MMIPs耦合发酵
6.4 结论
第七章 结论
7.1 菌种优化
7.2 发酵工艺优化
3代谢网络及前体促进效果"> 7.3 GA3代谢网络及前体促进效果
7.4 发酵过程建模及补料
7.5 吸附耦合发酵
参考文献
附件A
附录B
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]无机微粒添加对丝状微生物发酵过程的影响[J]. 牛坤,毛健,郑裕国. 微生物学报. 2015(03)
[2]大孔树脂对内生真菌Berkleasmium sp.Dzf12中Palmarumycins C12和C13积累的促进作用[J]. 牟燕,周开谊,徐丹,于瑞婷,李京,岳阳,周立刚. 天然产物研究与开发. 2015(02)
[3]反应分离耦合制备燃料乙醇研究进展[J]. 冯娇,王震,何珣,陈可泉,欧阳平凯. 广西科学. 2015(01)
[4]代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素[J]. 王贝贝,施明雨,王冬,许骄阳,刘怡,杨洪江,戴住波,张学礼. 生物工程学报. 2014(08)
[5]黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用[J]. 唐文俊,夏建业,储炬,庄英萍,张嗣良. 生物工程学报. 2015(02)
[6]利用特比萘芬抗性筛选赤霉素高产菌株及相关发酵特性的研究[J]. 王卫,黎继烈,黄卫文,李忠海,曾柏全. 微生物学通报. 2014(09)
[7]紫杉二烯人工酵母的代谢组学分析[J]. 闫慧芳,丁明珠,元英进. 生物工程学报. 2014(02)
[8]大肠杆菌苏氨酸合成途径动力学模型的构建与分析[J]. 杨雪,张彦飞,郑阳阳,马红武. 生物工程学报. 2014(01)
[9]奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析[J]. 李婷兰,韦柳静,范宇翔,马玉栋,白林泉,花强. 华东理工大学学报(自然科学版). 2013(06)
[10]有机氮源氨基酸组成对克拉维酸发酵的影响[J]. 何伟,冯涛,王永红,储炬,张嗣良. 华东理工大学学报(自然科学版). 2013(06)
博士论文
[1]基于多尺度创新原理的工业微生物高通量筛选平台构建及应用研究[D]. 谭俊.华东理工大学 2013
[2]始旋链霉菌普那霉素发酵及与分离耦合工艺研究[D]. 贾波.浙江大学 2007
[3]土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索[D]. 魏培莲.浙江大学 2007
硕士论文
[1]膜分离技术耦合发酵法制备麻黄碱的工艺研究[D]. 刘志昌.湖北工业大学 2009
[2]青霉素发酵过程的模型化研究[D]. 耿俊.上海交通大学 2009
[3]代谢网络及路径（pathway）的研究和应用[D]. 刘蓉.中南林业科技大学 2008
[4]赤霉菌萜类代谢途径工程基础研究[D]. 肖薇.中国协和医科大学 2008
[5]赤霉菌基因改造用于工程化组合产生紫杉烷类化合物的基础研究[D]. 貊润翌.中国协和医科大学 2007
[6]赤霉素高产菌株改造与发酵研究[D]. 庄木坤.华中农业大学 2007
[7]抗真菌抗生素生产菌的选育及其代谢物组初步研究[D]. 陈伟.天津大学 2007
[8]豆油影响藤仓赤霉菌978产GA3发酵的研究[D]. 王继刚.华中农业大学 2005
[9]前体物对Maituolaimycin生物合成的影响及相关代谢通量分析[D]. 郑卉.天津大学 2005
[10]细菌L-乳酸发酵及其代谢通量分析的研究[D]. 乐晓洁.天津科技大学 2004
本文编号：2922661
【文章来源】：中南林业科技大学湖南省
【文章页数】：179 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 赤霉素化学结构与生物活性
1.1.1 赤霉素化学结构
3生物活性"> 1.1.2 赤霉素GA3生物活性
1.2 赤霉素生产菌株遗传特性及研究现状
1.2.1 赤霉素生产菌株研究进展
1.2.2 赤霉菌合成赤霉素分子机理
1.3 高产菌株诱变与筛选
1.3.1 诱变育种方法
1.3.2 常用筛选技术
1.3.3 赤霉素高产菌株筛选
1.4 赤霉素发酵现状与优化策略
1.4.1 培养基各组分对发酵影响
1.4.2 发酵培养环境条件确立
1.4.3 赤霉素发酵动力学研究
1.4.4 赤霉素流加补料发酵
1.4.5 赤霉素代谢网络分析
1.4.6 发酵前体筛选
1.4.7 提取分离耦合发酵技术
1.5 赤霉菌产赤霉素机理解析对其他产物合成的意义
1.5.1 作为紫杉醇合成基因改造的宿主菌
1.5.2 作为生物转化制备药物中间体
1.5.3 作为调节其他途径产物因素
1.6 本研究目的与意义
3菌株定向高效选育">第二章 高产GA3菌株定向高效选育
2.1 前言
2.1.1 赤霉素生产菌株现状与保藏
2.1.2 高产菌株诱变
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株
2.2.2 培养基
2.2.3 培养方法
2.2.4 诱变处理
2.2.5 突变株筛选
2.2.6 菌株遗传稳定性
2.2.7 分析检测方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 赤霉素菌丝断裂效果
2.3.2 产脂肪酶突变株的选育
2.3.3 利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产菌株
2.3.4 特比萘芬抗性筛选赤霉素高产菌株
2.3.5 菌株ZNL13-3发酵特性研究
2.4 结论
3摇瓶发酵条件研究">第三章 赤霉素GA3摇瓶发酵条件研究
3.1 前言
3发酵影响"> 3.1.1 营养条件及种子对GA3发酵影响
3发酵影响"> 3.1.2 温度、pH对GA3发酵影响
3分批发酵影响"> 3.1.3 溶氧DO对GA3分批发酵影响
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株
3.2.2 培养基
3.2.3 培养方法
3.2.4 分析方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 种子生长及种龄的确定
3摇瓶发酵过程的影响"> 3.3.2 环境条件对GA3摇瓶发酵过程的影响
3发酵过程的影响"> 3.3.3 营养条件对GA3发酵过程的影响
3合成摇瓶发酵过程分析"> 3.3.4 GA3合成摇瓶发酵过程分析
3.3.5 不同pH值控制对发酵过程的影响
3分批发酵影响"> 3.3.6 温度对GA3分批发酵影响
3发酵影响"> 3.3.7 溶氧DO值对GA3发酵影响
3发酵的影响"> 3.3.8 发酵环境对赤霉素GA3发酵的影响
3.4 结论
3合成代谢网络分析与前体筛选">第四章 GA3合成代谢网络分析与前体筛选
4.1 前言
4.1.1 代谢控制分析-揭示细胞代谢的动态变化规律
4.1.2 系统代谢流控制机制
4.1.3 代谢工程基本原理和萜类代谢工程进展
4.1.4 赤霉素代谢网络构建
4.2 试剂与方法
4.2.1 菌株及药品
4.2.2 培养基与培养方法
4.2.3 分析方法
4.2.4 代谢过程及通量分析
4.2.5 前体促进剂筛选实验设计
4.3 结果及讨论
4.3.1 静息培养赤霉菌菌龄筛选
4.3.2 固定化菌丝静息流化产素研究
3合成代谢网络的构建"> 4.3.3 GA3合成代谢网络的构建
3代谢网络通量计算"> 4.3.4 GA3代谢网络通量计算
3合成极限得率"> 4.3.5 代谢网络推测GA3合成极限得率
4.3.6 最优前体促进剂组成
4.4 结论
3发酵过程建模与控制策略">第五章 GA3发酵过程建模与控制策略
5.1 前言
5.1.1 发酵过程建模类型
5.1.2 动力学参数求解
3分批发酵动力学"> 5.1.3 赤霉素GA3分批发酵动力学
5.1.4 发酵过程优化与控制
5.1.5 菌丝形态与发酵生产
5.2 实验与方法
5.2.1 菌株及药品
5.2.2 培养基
5.2.3 实验方法
5.2.4 分析方法
5.3. 结果与讨论
3发酵过程变化"> 5.3.1 赤霉素GA3发酵过程变化
3分批发酵动力学模型"> 5.3.2 GA3分批发酵动力学模型
5.3.3 分批发酵动力学模型的评价
5.3.4 模型模拟优化补料流速
3发酵模型"> 5.3.5 引入菌丝生理状态的GA3发酵模型
5.4 本章小结
3耦合发酵中的应用">第六章 磁性分子印迹微球构建及在GA3耦合发酵中的应用
6.1 前言
6.1.1 耦合发酵技术
6.1.2 磁性分子印迹载体
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株与材料
6.2.2 实验方法
6.2.3 磁性分子印迹载体制备
6.2.4 印迹微球的吸附性能研究及其表征
6.2.5 MMIPs耦合发酵
6.2.6 分析方法
6.3 结果与讨论
6.3.1 大孔树脂静态筛选
6.3.2 树脂D-100添加工艺单因素分析
6.3.3 中心组合方法优化耦合发酵工艺
3分子印迹微球MMIPs的表征"> 6.3.4 磁性GA3分子印迹微球MMIPs的表征
6.3.5 分子印迹MMIPs耦合发酵
6.4 结论
第七章 结论
7.1 菌种优化
7.2 发酵工艺优化
3代谢网络及前体促进效果"> 7.3 GA3代谢网络及前体促进效果
7.4 发酵过程建模及补料
7.5 吸附耦合发酵
参考文献
附件A
附录B
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]无机微粒添加对丝状微生物发酵过程的影响[J]. 牛坤,毛健,郑裕国. 微生物学报. 2015(03)
[2]大孔树脂对内生真菌Berkleasmium sp.Dzf12中Palmarumycins C12和C13积累的促进作用[J]. 牟燕,周开谊,徐丹,于瑞婷,李京,岳阳,周立刚. 天然产物研究与开发. 2015(02)
[3]反应分离耦合制备燃料乙醇研究进展[J]. 冯娇,王震,何珣,陈可泉,欧阳平凯. 广西科学. 2015(01)
[4]代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素[J]. 王贝贝,施明雨,王冬,许骄阳,刘怡,杨洪江,戴住波,张学礼. 生物工程学报. 2014(08)
[5]黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用[J]. 唐文俊,夏建业,储炬,庄英萍,张嗣良. 生物工程学报. 2015(02)
[6]利用特比萘芬抗性筛选赤霉素高产菌株及相关发酵特性的研究[J]. 王卫,黎继烈,黄卫文,李忠海,曾柏全. 微生物学通报. 2014(09)
[7]紫杉二烯人工酵母的代谢组学分析[J]. 闫慧芳,丁明珠,元英进. 生物工程学报. 2014(02)
[8]大肠杆菌苏氨酸合成途径动力学模型的构建与分析[J]. 杨雪,张彦飞,郑阳阳,马红武. 生物工程学报. 2014(01)
[9]奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析[J]. 李婷兰,韦柳静,范宇翔,马玉栋,白林泉,花强. 华东理工大学学报(自然科学版). 2013(06)
[10]有机氮源氨基酸组成对克拉维酸发酵的影响[J]. 何伟,冯涛,王永红,储炬,张嗣良. 华东理工大学学报(自然科学版). 2013(06)
博士论文
[1]基于多尺度创新原理的工业微生物高通量筛选平台构建及应用研究[D]. 谭俊.华东理工大学 2013
[2]始旋链霉菌普那霉素发酵及与分离耦合工艺研究[D]. 贾波.浙江大学 2007
[3]土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索[D]. 魏培莲.浙江大学 2007
硕士论文
[1]膜分离技术耦合发酵法制备麻黄碱的工艺研究[D]. 刘志昌.湖北工业大学 2009
[2]青霉素发酵过程的模型化研究[D]. 耿俊.上海交通大学 2009
[3]代谢网络及路径（pathway）的研究和应用[D]. 刘蓉.中南林业科技大学 2008
[4]赤霉菌萜类代谢途径工程基础研究[D]. 肖薇.中国协和医科大学 2008
[5]赤霉菌基因改造用于工程化组合产生紫杉烷类化合物的基础研究[D]. 貊润翌.中国协和医科大学 2007
[6]赤霉素高产菌株改造与发酵研究[D]. 庄木坤.华中农业大学 2007
[7]抗真菌抗生素生产菌的选育及其代谢物组初步研究[D]. 陈伟.天津大学 2007
[8]豆油影响藤仓赤霉菌978产GA3发酵的研究[D]. 王继刚.华中农业大学 2005
[9]前体物对Maituolaimycin生物合成的影响及相关代谢通量分析[D]. 郑卉.天津大学 2005
[10]细菌L-乳酸发酵及其代谢通量分析的研究[D]. 乐晓洁.天津科技大学 2004
本文编号：2922661
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