典型手性药物砌块酶促合成过程生产率强化关键技术研究

发布时间：2024-02-23 19:40

　　光学活性的手性砌块是许多药物的关键中间体,生物催化是制备高光学纯度手性药物砌块的重要方法。但是,许多生物催化过程由于酶表达量低、稳定性差、难以重复使用或反应过程参数设置不合理等技术问题,导致生产效率低、成本高,难以实现产业化应用。本论文选取三个手性药物砌块的酶促合成反应作为典型案例,针对其关键技术瓶颈问题,分别采用基因异源表达、酶固定化及过程再优化等不同策略,显著提高了所用生物催化剂的比生产率,有力促进了相关生物催化过程的产业化应用,并为其他酶促反应的合成应用提供了成功案例。1.针对野生型微生物中酶表达水平不高导致粗酶制剂比生产率低下的问题,本文以西司他汀前体(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的酶促合成为案例,通过对实验室前期分离的野生型红球菌ECU1013的酯酶基因进行克隆和异源表达,强化了酶的表达水平,极大地提高了酶制剂的催化效率。重组酶制剂的比生产率提高了13倍,酶促反应底物上载量由62.5 mM提高到500 mM,反应时间由120 h缩短为16 h。在十克级规模制备实验中,产品分离收率30.2%(最大理论转化率为50%),光学纯度为97.4%ee。2.针对游离酶稳定性差、难以重...

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【部分图文】：

图２．１基因文库的Ｈ了酸甘油酷平板初筛??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕｔｙｒａｔｅ．??

图２．１基因文库的Ｈ了酸甘油酷平板初筛??ｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕ圈的菌落进行培养，菌体离也，用ＫＰＢＯＯＯｍＭＤｍｍ，°，

图２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图??

?０．１７?３．０??纯化的酶通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行分析，达到单一条带的纯度，见图２．３，其分子量大约??为３５．０ｋＤａ。进而采用ＴＳＫＧ２０００ＳＷＸ１蛋白质层析柱对酶进行分子量分析，洗脱的蛋白??同样呈现单一条带，其表观分子量为６９．８?ｋＤａ。结果表明ｉ？ＡＥｓｔｌ是一....

图２．４?ｐＨ对ＷｆＥｓｔｒ活性的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｐＨ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?／？ＡＥｓｔｌ．??

（Ａ：?ＰＥＴ２８ａ）?（Ｂ：?ｐＥＴ４３ａ）??图２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?３．２?Ｓｏｄｉｕｍ?ｄｏｄｅｃｙｌ?ｓｕｌｆａｔｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２．....

图２．５温度对／？々Ｅｓｔｌ活性的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??

图２．５温度对／？々Ｅｓｔｌ活性的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??随后分别在３０、４０和５０°Ｃ条件下考察了Ｗ；Ｅｓｔｌ的温度稳定性，其失活曲线见图２．６，??在３０、４０和....

本文编号：3907870