荧光氧气纳米传感器的构建及在肿瘤细胞线粒体功能障碍评估中的应用

发布时间：2016-11-21 11:03

  本文关键词：荧光氧气纳米传感器的构建及在肿瘤细胞线粒体功能障碍评估中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

《北京交通大学》 2015年

荧光氧气纳米传感器的构建及在肿瘤细胞线粒体功能障碍评估中的应用

王小卉  

【摘要】：氧含量的检测在医学和生物学等领域有着非常重要的意义,荧光氧气纳米传感器常被用于检测细胞或组织的溶氧量。线粒体是有氧呼吸的主要场所,其代谢损伤会导致肿瘤等疾病的发生,基于溶氧量的检测可表征线粒体的呼吸速率,进而评估肿瘤细胞线粒体的功能状态。然而,当前的传感器主要针对细胞外或者细胞内的溶解氧检测,难以精确测定线粒体内的氧含量变化。本论文主要研究生物兼容高灵敏度荧光氧气纳米传感器的构建,并通过对线粒体呼吸速率的荧光检测,评估肿瘤细胞线粒体功能障碍。 本论文的主要研究内容及结果如下： 1、利用再沉淀-包覆法制备掺杂氧气荧光探针分子和参比物质的比率荧光氧气纳米传感器,通过多聚赖氨酸大分子(PLL)的表面修饰使纳米传感器具有较低的毒性和有效的细胞摄取率。首先以PMMA和BTD为基质将疏水性的氧气探针分子PtOEP和荧光参比分子C6封装到纳米颗粒内,随后利用纳米颗粒表面硅醇的负电性和PLL分子的正电性之间的静电吸引,制备PLL包覆的PtOEP/C6掺杂的PMMA基质荧光氧气纳米传感器。该荧光氧气纳米传感器的氧气猝灭率为77%,可通过非线性Stem-Volmer公式进行拟合,由于PLL的修饰使其具有良好的生物相容性和较高的细胞摄取率。在此基础上,我们利用PS代替PMMA,并且将可以进行能量传递的荧光团DNM与PtOEP、 C6同时封装到PS基质纳米颗粒内,制备了PLL包覆的PtOEP/DNM/C6掺杂的PS基质荧光氧气纳米传感器。该纳米传感器的氧气猝灭率达到94%,其比率荧光与溶氧量之间具有良好的线性关系,并且可以被细胞有效吞噬,在细胞内呈现良好的比率荧光成像。 2、通过碳二亚胺反应在PLL包覆氧气纳米传感器表面修饰亲脂性阳离子TPP,实现了对细胞线粒体的靶向定位。首先研究了PLL包覆纳米颗粒的自组装形成机理,认为采用10mg/L的MH-PLL (Mw=30-70kDa)包覆制成的纳米颗粒具有最佳的形貌、大小和zeta电势。基于zeta电势方法和荧光胺方法对纳米颗粒进行分析,发现PLL壳层中存在三种类型的氨基基团,分别位于壳层的内部、中部和表面,其中表面氨基浓度为12nmo1/mL。通过碳二亚胺反应将TPP基团偶联到纳米颗粒表面,利用核磁共振和吸收光谱分析证明TPP偶联修饰得到实现。对TPP偶联纳米颗粒进行共聚焦显微镜成像和断层扫描成像,证明其可以被细胞有效摄取,并成功地靶向细胞线粒体。 3、制备了三类分别靶向细胞外、细胞内和线粒体内的荧光氧气纳米传感器,基于时间分辨荧光方法检测肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02的呼吸效率,评估肿瘤细胞线粒体的功能障碍。三类靶向性氧气纳米传感器具有相同的核心基质(包括PS、 DTS、C6和氧气探针PtTFPP),但表面壳层却各不相同,Si-NPs具有带负电的二氧化硅表面,PLL-NPs表面是带正电的PLL壳层,TPP-NPs表面偶联TPP基团。通过共聚焦显微镜和细胞超薄切片透射电子显微镜成像证明Si-NPs、PLL-NPs和TPP-NPs分别靶向细胞外、细胞内和线粒体。对负载三类纳米传感器的细胞在不同溶氧量环境中的荧光寿命进行检测,成功绘制细胞内纳米传感器的溶氧量标定曲线。基于靶向性纳米传感器可以实时对亚细胞水平溶氧量梯度进行检测。对比肿瘤细胞和正常细胞在不同葡萄糖水平下的氧气消耗速率,发现肿瘤细胞有氧呼吸过程中的葡萄糖利用率较低。将FCCP刺激下的肿瘤细胞与正常细胞的呼吸速率进行对比,证明肿瘤细胞呼吸速率低,线粒体存在功能障碍。

【关键词】：
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TP212
【目录】：

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