快速特异检测大肠杆菌O157:H7的B细胞生物传感器研究

发布时间：2017-05-14 13:06

  本文关键词：快速特异检测大肠杆菌O157:H7的B细胞生物传感器研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：微生物污染引起的食物中毒是国内外食品安全领域中的主要问题,目前急需发展一个新型、快速、特异和灵敏的检测食品中致病菌的方法。本课题结合细胞生物学、免疫学、光学等技术领域的最新成果,以大肠杆菌0157:H7(Escherichiacoli O157：H7)为模式菌,探讨了以B细胞作为生物传感器受体元件检测食源性致病菌的可能性,并研究了两种基于B细胞的生物传感器技术。1.E.coli O157：H7和B细胞的相互作用研究了特异性表达抗E.coli O157的IgM的B细胞作为生物传感器中识别元件的生长特性和I gM的活性。用流式细胞术研究B细胞捕获不同浓度E.coli0157：H7的情况,以及B细胞与E.coli O157：H7孵育不同时间后的活力。结果显示,该B细胞具有I gM活性,当与E.coli O157：H7孵育1小时,不同浓度细菌对B细胞活力均无影响;表明该B细胞可以作为生物传感器中的生物识别元件用于构建基于细胞的生物传感器进行食源性大肠杆菌检测。2.基于化学钙离子指示剂B细胞生物传感器的构建该试验目的是开发一个基于化学钙离子指示剂的B细胞生物传感器。当加载了Fura-2的B细胞与菌体接触后,B细胞受体(B cell receptor, BCR)介导的钙离子信号通路被激活,由此导致胞质内钙离子浓度在数秒内升高,高浓度钙离子与Fura-2进行结合从而导致其荧光信号的改变以报道靶标致病菌的存在。本试验中的B细胞生物传感器在30μL体系中,可以检测E. coli 0157:H7的菌体数量低至18个细胞,检测范围为102至105 CFU/mL,检测时间从样品准备到检测可在10 min左右完成。最后,用该B细胞生物传感器对非靶标致病菌和食品样品中的E. coli 0157:H7进行了检测,发现该传感器显示出了优良的特异性。3.基于遗传工程钙离子指示剂B细胞生物传感器的构建在该试验中,使用一个遗传编码的钙离子指示剂(genetically encoded Ca2+ indicators,GECI)作为报告子,构建了一个基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的B细胞生物传感器。当E. coli 0157:H7与B细胞膜表面的IgM结合时会激活BCR介导的钙离子信号通路,导致胞内钙离子浓度的瞬时增强,继而触发GECI TN-XXL的FRET发生以报告致病菌的存在。结果证实TN-XXL和基于FRET的方法构建出的B细胞生物传感器用于检测靶标致病菌具有高灵敏性,并可以在10 min内完成检测并无需样品的前富集。这可以构建一个通过观测BCR激活而用于检测致病菌存在的通用方法,可用于检测对B细胞有特异性的致病菌。这两种技术可以实现对大肠杆菌0157：H7快速、灵敏和特异的检测,为今后细胞生物传感器用于食品中大肠杆菌或其他重要食源性致病菌的快速检测奠定了工作基础。
【关键词】：E.coli 0157:H7 B细胞 生物传感器 钙离子指示剂 FRET
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TP212
【目录】：

• 致谢7-9
• 摘要9-11
• Abstract11-18
• 主要符号列表18-22
• 1. 绪论22-50
• 1.1 食源性致病菌22-26
• 1.2 生物传感器26-39
• 1.2.1 检测致病菌的不同方法26-29
• 1.2.2 生物传感器29-39
• 1.3 基于细胞的生物传感器39-46
• 1.3.1 基于哺乳动物细胞的检测系统39-40
• 1.3.2 基于细胞检测食源性致病菌40-44
• 1.3.3 CBBs的局限性44-46
• 1.4 本文研究对象与内容46-50
• 1.4.1 研究对象46-47
• 1.4.2 研究内容47-48
• 1.4.3 研究目标48
• 1.4.4 技术路线48-50
• 2. B细胞和B. coli O157：H7的相互作用50-66
• 2.1 引言50-51
• 2.2 材料和方法51-55
• 2.2.1 试验试剂51-52
• 2.2.2 细胞培养和生长曲线52
• 2.2.3 细菌菌株和培养条件52-53
• 2.2.4 ELISA53
• 2.2.5 B细胞对细菌捕获53
• 2.2.6 细菌对B细胞凋亡的影响53-54
• 2.2.7 统计学分析54-55
• 2.3 结果55-62
• 2.3.1 B细胞的生长55
• 2.3.2 ELISA55-56
• 2.3.3 B细胞对细菌的捕获56-58
• 2.3.4 细菌对B细胞凋亡的影响58-62
• 2.4 讨论62-64
• 2.5 结论64-66
• 3. 基于化学钙离子指示剂的B细胞生物传感器构建66-86
• 3.1 引言66-70
• 3.2 材料和方法70-74
• 3.2.1 试验试剂70
• 3.2.2 细胞培养条件70-71
• 3.2.3 细菌菌株和培养条件71-72
• 3.2.4 扫描电镜成像72
• 3.2.5 B细胞生物传感器的制备72
• 3.2.6 纯培养物中E.coli O157：H7的检测72-73
• 3.2.7 牛肉样品中E.coli O157：H7的检测73
• 3.2.8 统计学分析73-74
• 3.3 结果74-82
• 3.3.1 B细胞生物传感器的优化74-76
• 3.3.2 纯培养物中E.coli O157：H7的检测76-80
• 3.3.3 食品样品中E.coli O157：H7的检测80-82
• 3.4 讨论82-85
• 3.5 结论85-86
• 4 基于遗传工程钙离子指示剂的B细胞生物传感器构建86-104
• 4.1 引言86-89
• 4.2 材料和方法89-93
• 4.2.1 试验试剂89-90
• 4.2.2 细胞培养和转染条件90
• 4.2.3 细菌菌株和培养条件90-91
• 4.2.4 扫描电镜成像91
• 4.2.5 FRET试验91-92
• 4.2.6 细菌的检测92
• 4.2.7 统计学分析92-93
• 4.3 结果93-99
• 4.3.1 质粒的验证与转染93-94
• 4.3.2 B细胞和细菌的相互作用的扫描电镜成像94-95
• 4.3.3 受体光漂白技术对FRET的研究95-97
• 4.3.4 细菌的检测97-99
• 4.4 讨论99-102
• 4.5 结论102-104
• 5. 结论与展望104-108
• 5.1 研究结论104-105
• 5.2 创新点105
• 5.3 展望105-108
• 参考文献108-120
• 作者简介120-12

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