茶叶科学研究所_食品工业科技_【茶叶科学杂志】茯砖茶发花微生物生物学特性

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《茶叶科学杂志》2016年第二期

摘要：

在探明湖南省冬夏两季茯砖茶发花期间真菌种群的生长特性及演替规律的基础上，试验对分离鉴定的27株真菌微生物开展了不同培养基、碳源、氮源、温度等生物学特性研究，探讨不同菌株菌丝生长及产孢的情况。结果表明，所有的发花微生物均能在茶汁培养基上生长，在不同碳、氮源的培养基上以单糖、二糖和有机氮源为碳、氮源的培养基上菌丝生长较快且利于产孢，发花微生物生长的最适温度为25~30℃，超过30℃或低于25℃将会抑制生长。但不同发花微生物个体之间又存在着一定差别，表明不同季节茯砖茶发花微生物的种类和演变规律与发花微生物自身的生物学特性存在着紧密联系。

关键词：

茯砖茶；发花微生物；生物学特性

茯砖茶是一种紧压黑茶，具有显著的消滞减肥作用[1-3]。近年来，随着人们生活水平的提高，膳食结构的变化，茯砖茶的消费区域不断扩大、需求量在快速增长[4-5,12-13]。茯砖茶以黑毛茶为原料，经过筛切、拼配、汽蒸渥堆、压制、发花干燥等一系列工艺制作而成。其中，“发花”是茯砖茶加工过程中特有的工序，通过精确控制烘房内的温、湿度等环境条件，促使目标有益菌——冠突散囊菌的生长繁殖，以产生大量的金黄色的闭囊壳，俗称“金花”[4]，茯砖茶中“金花”的质量和数量是评价产品质量的关键。研究表明，在发花过程中，由于温、湿度适宜，茶坯中的各种微生物相继迅速繁殖，经过一段时间随着茶坯中物质的逐渐分解，代谢产物开始积累，环境条件不断变化，微生物区系随发酵时间而改变，原来有的各微生物的数量开始下降，取而代之的是一群高度特异化的微生物——冠突散囊菌，即通过各种微生物类群之间的反复较量，其中最适合在这种环境中生长的微生物种类则最终取得优势[6-7]。之前有学者对茯砖茶发花优势微生物的生物学特性进行了分析[8-11]，而与之伴随生长的其他微生物生物学特性未有报道。本实验通过对湖南省冬夏两季生产过程中的茯砖茶进行取样，分离出27种真菌微生物，在实验室条件下对其开展生物学特性研究，以期阐明不同季节茯砖茶发花微生物的种类和演替的差异，为进一步研究提供参考。

1材料与方法

1.1菌株来源供试菌株为27株真菌微生物，其中20株为湖南省冬季茯砖茶发花期间分离得到，另外7株为夏季茯砖茶发花期间分离得到。

1.2试验方法和内容

1.2.1供试菌株的培养和形态观察取供试的27株真菌，常温下复苏24h后，转接于查氏培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养7d。

1.2.2培养基的制备浸提黑毛茶，其中茶汁浸提条件为：茶水比：1∶30，温度100℃，时间：30min，供试培养基共6种。M1：茶汁1000mL，琼脂20.0g。M2：茶汁l000mL，蔗糖20.0g，琼脂20.0g。M3：茶汁1000mL，蔗糖20.0g，琼脂20.0g，马铃薯200.0g。M4：PSA培养基：蔗糖20.0g，琼脂20.0g，马铃薯200.0g，蒸馏水1000mL。M5：查氏琼脂培养基：硝酸钠3.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁(MgSO4•7H2O)0.5g，硫酸亚铁(FeSO4)0.01g，蔗糖30.00g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。M6：水琼脂培养基：琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，分别于121℃灭菌20min备用。

1.2.3供试菌株在不同培养条件下生长状况研究（1）培养基：将27株供试菌株分别接种在M1、M2、M3、M4、M5、M6上，置于28℃培养箱中，培养3d，然后测定菌落直径并观察菌落形态，每个处理设3次重复。（2）碳源：以查氏培养基为基本培养基，其中蔗糖分别替换成葡萄糖（C1）、蔗糖（C2）、麦芽糖（C3）、淀粉（C4），置于28℃培养箱中，金花菌培养7d，其余菌培养4d，每个处理设3次重复。（3）氮源：以查氏培养基为基本培养基，其中硝酸钠分别替换成KNO3（N1）、(NH4)2SO4（N2）、蛋白胨（N3）、牛肉膏（N4）、酵母膏（N5），置于28℃培养箱中，金花菌培养7d，其余菌培养4d，每个处理设3次重复。（4）温度：将27株供试菌株分别接种在准备好的PSA固体培养基中，分别置于20℃（T1）、25℃（T2）、28℃（T3）、30℃（T4）、35℃（T5）的条件下，培养3d，每个处理设3次重复。1.3试验数据测量与分析以上每个试验在每天的同一时间测量菌落直径。上述所有试验数据用Excel及SPSS19.0统计软件进行分析，用t检验及方差分析，检验各处理间的差异显著性。

2结果与分析

2.1供试菌株的三点菌落图冬季共分离鉴定出20株真菌，其中5株曲霉（Aspergillus）（图1中1~5），1株冠突散囊菌（Eurotiumcristatum）（图1中的6），7株青霉（Penicillium）（图1中7~13），2株芽枝霉（Phycomycetes）（图1中14~15），1株镰刀菌（Fusarium）（图1中16），1株木霉（Trichodermaspp.）（图1中17），2株毛霉（Mucor）（图1中18、19），1株酵母菌（Yeast）（图1中20）；夏季共分离鉴定出7株真菌，其中4株金花菌（图1中21~24），3株曲霉（图1中25~27）。27株真菌转接在查氏培养基中，25℃培养7d，菌落形态见图1。

2.2不同培养基对发花微生物生长的影响发花微生物在不同的培养基中，其菌丝生长速度和产孢数量显著不同。总体来看，发花微生物在M3和M4中生长较好，在M1和M2中次之，在M5中生长较慢，M6中最差，但不同发花微生物个体之间又存在一定的区别。从图2及冬季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态可知：（1）2株黑曲霉（图2中1~2），在M1、M2、M3、M4均能生长，且营养成分越充足时黑曲霉菌丝生长速度越快，产孢量也越多，但在M6中完全未生长，表明黑曲霉对营养成分要求较高。其他3株曲霉，在M6中有少量菌丝生长，表明这3株曲霉对营养要求不高，在其他培养基中具有与黑曲霉相似的生长规律。相比黑曲霉，冠突散囊菌（图2中6）生长速度较慢，且在M6中也是完全未生长，表明冠突散囊菌对营养成分要求较高；从冠突散囊菌在M1、M2与M5中生长情况对比发现，在M2中生长更好一些，表明茶汁营养成分丰富且比例协调，更有利于冠突散囊菌的生长；此外，在先前的研究中发现，茯砖茶在发花的第3天，茶砖内部有少量金花菌斑形成；而该菌接种在茶汁培养基中，置于28℃培养箱中，培养3d，可发现菌落稍显淡黄色，表明此菌生长速度较慢。（2）青霉（图2中7~13），从茯砖茶中分离到的7株青霉，对营养成分要求不高，茯砖茶坯可以满足其生长需要。（3）芽枝霉（图2中14~15），在M6中均能生长，尤其是芽枝霉2（图2中15），已有少量孢子产生，表明此菌对营养成分要求极低，在其他培养基中具有与黑曲霉相似的生长规律；试验发现在冬季茯砖茶发花中，最先分离到的就是芽枝霉2，推测与此菌的生物学特性有一定关联。（4）镰刀菌（图2中16），在M1中生长速度较快，表明茶汁中的营养成分已经可以满足其生长需要，在茯砖茶发花中占据生长优势。（5）木霉（图2中17），在M1中仅有少量菌丝生长，并无孢子产生，在M2、M3、M4、M5中生长相对较好，在M6中生长较差，表明此菌对营养成分要求较高。（6）毛霉（图2中18~19），在M1和M6中，生长相对较差，不具有生长优势，可以在茯砖茶坯中生长。（7）酵母菌（图2中20），可以在M6中生长，同时对比在M1和M5中的生长情况，表明茶汁中含有该菌生长所需的营养物质。从图2及夏季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态可知：（1）4株金花菌，在M6中几乎都不能生长，表明它们对营养成分要求相对较高；与第2、3株（图2中22、23）相比，第1、4株金花菌（图2中21、24）可以在M1中生长，对营养成分要求稍低，试验中也发现在夏季分离的微生物中，第1、4株金花菌数目相对较多，表明金花菌种族之间存在一定差异，但4株金花菌均可以在茯砖茶坯中生长。（2）3株曲霉，局限曲霉（图2中25），在M5和M6中几乎不能生长，，表明它对营养要求较高，不具生长优势；烟曲霉（图2中26），在M1、M3、M4中生长情况对比发现，在M4中生长最好，但在M3中生长相对较差，推测茶汁中可能含有抑制或不适宜此菌生长的物质，同时在试验中发现此菌在夏季发花茶样中的数目较少；黑曲霉（图2中27），与冬季分离到的黑曲霉具有相似的生长特征。

2.3不同碳、氮源对发花微生物生长的影响冬季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态（图3、图4）：（1）2株黑曲霉（图3中1~2），在C1中菌落直径最大，C3中次之，C2中最小；产孢数目对比，C1中最多，C2中次之，C3中最少；在C4中均未生长，表明单糖既利于菌丝生长又利于产孢，几乎不能利用多糖，对营养成分要求较高。在无机氮源的培养基中菌落直径明显小于有机氮源的培养基中，表明有机氮源更有利于黑曲霉的生长。其他3株曲霉，具有与黑曲霉相似的生长规律，但又有一定的差别，如：在C4中菌丝生长速度较快，且产生了孢子，表明这3株曲霉可以利用多糖。曲霉4（图4中的菌落4），在无机氮源的培养基中生长情况相似，在N5中产生的孢子数多些，而曲霉5（图4中5）是在N3中孢子数多些，表明不同微生物对氮源的选择不尽相同。冠突散囊菌（图3中6），具有与黑曲霉类似的生长规律，单糖有利于其菌丝生长，对多糖的利用率较差。有机氮源可以更好地促进冠突散囊菌的生长，但同时研究发现，冠突散囊菌在N3、N4中菌落直径大于在N5中，但在N5中却产生了大量黑色素，表明N3、N4可以促进冠突散囊菌菌丝的生长，N5可以促进孢子的成熟并分泌色素。（2）青霉，除了青霉1（图3中7）不能在C4中生长外，其他6株青霉均能生长，青霉3（图3中9）较为特殊，在C1和C4中生长情况相似，表明大部分的青霉可以利用多糖。无机氮源对青霉的生长促进不及有机氮源，且无机氮源中以硝态氮的促进作用较强，有机氮源有一定区别；青霉1（图4中7），酵母膏对其生长促进作用较强；青霉2~4（图4中8~10），蛋白胨对其生长促进作用较强；青霉5~7（图4中11~13），蛋白胨和酵母膏的促进作用相似，但牛肉膏的促进作用不如蛋白胨和酵母膏。（3）芽枝霉，在C1、C2、C3中均能正常生长，在C1和C2中生长几乎无差别，在C4中生长速度较慢，但可以产孢，表明芽枝霉利用多糖的能力较强。芽枝霉1（图4中14），在N2中菌丝生长速度快于以N1中，表明铵态氮源比硝态氮源更有利于该菌菌丝生长，在有机氮源的生长情况对比发现，N5促进作用最强，N3次之，N4最差；芽枝霉2（图4中15），在无机氮源培养基中菌丝生长速度相似，但在N1中产生了孢子，表明硝态氮源利于此株菌产孢，在有机氮源培养基中对比发现，酵母膏对其促进作用最强。（4）镰刀菌，在C1和C2中生长速度较快，差别不大，在C3中生长速度稍慢，在C4中生长明显受到抑制，生长速度最慢。无机氮源中，硝态氮源明显比铵态氮源的促进作用较强，菌落大，菌丝生长速度快；有机氮源中以酵母膏的促进作用最强，牛肉膏次之，蛋白胨最差。（5）木霉，在4种碳源的培养基上生长速度为：C1>C2>C4>C3，在C2和C4中生长情况相似，表明对多糖的利用能力强。无机氮源对菌丝生长速度和产孢促进方面明显不及有机氮源，无机氮源中，硝态氮源的促进作用低于铵态氮源，有机氮源中牛肉膏最差，蛋白胨次之，酵母膏最强。（6）毛霉1~2（图3中18~19），在C1和C2中生长正常，在C3中生长开始受到抑制，毛霉1在C4中几乎不能生长，但毛霉2在C4中形成了一定菌斑，尽管菌落直径较小，表明毛霉2具有一定的多糖利用能力。2株毛霉对无机氮源的利用情况有一定差别，毛霉1，硝态氮源的促进作用不及铵态氮源；毛霉2，与毛霉1正好相反。有机氮源中，2株毛霉相似，牛肉膏最差，蛋白胨次之，酵母膏的促进作用最强。（7）酵母菌，在C1、C2、C3中生长较为相似，在C4中完全不能生长，表明此菌对碳源有一定的要求。有机氮源的促进作用强于无机氮源，有机氮源中，蛋白胨最差，牛肉膏次之，酵母膏最强；无机氮源中，硝态氮源不及铵态氮源。夏季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态（图3、图4）：（1）金花菌，在C1中生长最好，在C4中除第1、3株金花菌（图3中21~23）可以勉强生长外，第2、4株金花菌（图3中22~24）均不能生长。4株金花菌，总体看，有机氮源的促进作用强于无机氮源；有机氮源方面，大体相似，蛋白胨和牛肉膏的促进作用不及酵母膏。无机氮源方面，第1、3株金花菌类似，铵态氮源的促进作用强于硝态氮源；第2、4株金花菌相似，硝态氮源的促进作用强于铵态氮源。（2）3株曲霉，局限曲霉（图3中25），在C1、C2、C3中可以缓慢生长，在C4中不能生长；无机氮源促进作用相似，有机氮源中酵母膏的促进作用相对较强。烟曲霉（图3中26），在C1、C2中生长较快，差别不大，在C3中生长略慢，在C4中也可以生长，生长速度更为慢些；硝态氮源的促进作用不及铵态氮源，有机氮源的促进作用与局限曲霉相似。黑曲霉（图4中27），与冬季茯砖茶样品中分离到的黑曲霉具有相似的生长规律。碳、氮源是微生物生存必需的营养物质，总体来看，发花微生物在以葡萄糖和蔗糖为碳源的培养基中生长最好，麦芽糖次之，淀粉较差；相比无机氮源，有机氮源对菌丝生长速度影响明显，但不同发花微生物之间又有一定区别。

2.4不同温度对发花微生物生长的影响温度对微生物的生长影响显著，大部分发花真菌微生物在低于20℃或超过35℃时，生长会受到抑制，但不同发花微生物其最适生长温度具有一定的差异性。冬季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态（图5）：（1）2株黑曲霉（图5中1~2），在试验的温度区间内，菌落直径及产孢数目与温度成正比。其他3株曲霉，曲霉3（图5中3）与黑曲霉具有相似的生长规律；曲霉4（图5中4），在T1~T3，菌落直径与温度成正比，从T4以后，生长明显受到抑制，在T5时停止生长；曲霉5（图5中5），在T1~T4，菌落直径与温度成正比，在T5时，生长受到了抑制。冠突散囊菌（图5中6），在T1时，未见生长，在T5时，生长受到抑制，在T2~T4，菌落直径与温度成正比。（2）青霉，在T3之前，菌落直径与温度成正比，T3之后，菌落直径与温度成反比。（3）芽枝霉，在T1~T2，菌落直径与温度成正比，在T3~T5，菌落直径与温度成反比，在T5时停止生长。（4）镰刀菌，在T1~T4，菌落直径与温度成正比，气生菌丝也愈发致密，在T5时，生长受到抑制。（5）木霉，在T1~T4，菌落直径与温度成正比，在T5时，生长受到抑制。（6）毛霉1（图5中18），在T1~T4，菌落直径与温度成正比，在T5时，生长受到抑制；毛霉2（图5中19），在T3之前，菌落直径与温度成正比，在T4之后，生长受到抑制，T5时，抑制作用明显。（7）酵母菌，在T4之前，菌落直径与温度成正比，T5时，生长受到一定抑制，但该菌在T1~T5，均可生长。夏季茯砖茶发花微生物在培养基中的菌落形态（图5）：（1）4株金花菌，在T1~T4，菌落直径与温度成正比，T5时生长受到抑制，但4株金花菌最适生长温度又不尽相同。在T1时，4株金花菌都未见生长；T2时，第1株（图5中21）、4株（图5中24）开始生长，且已产生了闭囊壳，第2株（图5中22）、3株（图5中23）仅有少量菌丝产生；T3~T4，菌落直径与温度成正比，且闭囊壳数目逐渐增多，T5时，第2株金花菌的生长受到的抑制作用明显强于其他3株。（2）3株曲霉，其中局限曲霉，在T4以后，生长开始受到抑制，其他2株曲霉，在试验的温度区间内，菌落直径与温度始终成正比。

3讨论

茯砖茶的发花工艺其实质是培育有益菌——冠突散囊菌的生长繁殖，通过空气中的微生物自然接种，经过反复较量，冠突散囊菌最终占据优势，这是一种自然选择的结果。由于不同季节外界条件差异明显，发花环境中微生物区系有差异，加之微生物自身的生长特性，因此不同季节茯砖茶发花微生物的种群及演替规律有差异。通过对不同季节茯砖茶发花期间分离的微生物的生物学特性研究发现，不同微生物对其生长物质，如碳氮源，利用能力有区别，表明发花微生物对营养成分的需求不一。从发花微生物的演变上来看，一般最先分离出来的不是冠突散囊菌，而是其他利用多糖能力较强的微生物，通过其创造一定条件，有利于冠突散囊菌繁殖发育，最终占据优势，表明在茯砖茶发花中微生物的演变与它们的生物学特性有较大的关联。外界温度对发花微生物的生长也具有重要影响，一般真菌微生物能在20~35℃之间生长，但不同微生物对温度的敏感程度不尽相同。冬季烘房温度偏低，在24~28℃之间，而夏季烘房温度偏高，在30~35℃之间。因此，冬夏两季分离出的微生物从种类和长势上差异较大。生产中，为满足发花微生物的生长与发育，在茶坯压制前添加熬制老茶梗汁液或者一定比例的蔗糖，有利于茯砖茶的发花，有利于提高“金花”的数量和大小。过去有研究[14]认为，茯砖茶发花中，除冠突散囊菌外，其他霉菌等是污染微生物，或为“杂菌”，应在生产中加以控制。上述研究发现，茯砖茶坯发花时最先生长的微生物并非是冠突散囊菌。如冬季发花的茯砖茶，最先生长的是芽枝霉，然后是青霉和冠突散囊菌等这些微生物逐渐生长，通过不断的较量，最终冠突散囊菌成为优势微生物，在此期间，发生了复杂的变化。这些“杂菌”的存在应具有一定作用。又如木霉等能够很好地利用多糖，可以降解茶叶中的多糖，如纤维素，分解为葡萄糖等单糖，有利于冠突散囊菌的生长发育。实验表明，冬季发花的茯砖茶“杂菌”较多，最终冠突散囊菌的数目也较多；夏季发花的茯砖茶“杂菌”较少，最终茯砖茶成品中冠突散囊菌的数目也较少，这是值得进一步研究的问题。发花工艺是茯砖茶品质形成的关键步骤，在目前的茯砖茶生产中，主要是通过人工控制一定的环境条件，促使优势微生物生长繁殖，但受外界环境影响较大，茯砖茶质量不稳定。

通过对不同季节茯砖茶发花期间微生物种类、演替规律及生物学特性，并结合生产过程中茯砖茶发花控制条件的研究，一方面从理论上解释了不同季节茯砖茶发花微生物种类的差异性，另外为进一步开发茯砖茶现代化的精准诱导调控发花工艺奠定了基础。

作者：赵仁亮 谭吉慧 卢秦华 吴丹 朱旗 单位：湖南农业大学茶学教育部重点实验室 国家植物功能成分利用工程技术研究中心

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