有机磷降解酶基因（opdA）在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中的表达与酶学研究
发布时间：2023-04-10 01:32
有机磷农药(organophosphates, OPs)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，在保护农作物免受病虫害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用。但它们对人类的生存环境造成了严重的污染，并导致瓜果与蔬菜等农产品农药残留超标，直接危害人类与动物的健康。所以有机磷农药降解方面的研究在环境保护和食品安全方面受到了高度关注。 研究发现，一些能降解有机磷农药的降解菌的降解作用是通过产生有机磷降解酶来实现的。而直接使用此类有机磷降解酶降解有机磷农药的效率远高于使用产生此类酶的降解菌。 来源于土壤杆菌属Agrobacterium radiobacter P230的有机磷降解酶(OpdA)具有底物范围广和催化效率高的特点，因此被公认为是迄今为止最具有应用前景的有机磷降解酶。有机磷降解酶通过水解有机磷农药的磷脂键，最终实现有机磷农药的无毒化。本研究旨在利用已有的研究基础，建立有机磷降解酶基因(opdA)大肠杆菌表达系统，实现其高效表达；同时对枯草芽孢杆菌的电转化条件进行优化，建立高效的电转化方法，并构建有机磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达系统，克服重组蛋白在大肠杆菌表达系...
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 引言
1.2 降解有机磷农药的微生物及其降解酶的研究进展
1.2.1 降解有机磷农药的微生物
1.2.2 有机磷降解酶
1.2.3 有机磷降解酶编码基因
1.3 有机磷降解酶（OpdA）的简介
1.4 有机磷降解酶 OpdA 的作用机理
1.4.1 OpdA 活性位点与金属配位
1.4.2 OpdA 的作用机制
1.5 大肠杆菌表达系统的研究进展
1.6 食品级表达系统
1.7 枯草芽孢杆菌分泌表达系统的研究进展
1.8 立文依据与研究内容
第二章 有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌中的高效表达与酶学研究
2.1 引言
2.2 实验材料、仪器与试剂
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 试剂
2.2.3 培养基及有关溶液的配制
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 有机磷降解酶基因（opdA）大肠杆菌表达载体的构建
2.3.2 有机磷降解酶基因（opdA）在大肠杆菌 BL21 中诱导表达及条件的优化
2.3.3 OpdA 重组蛋白的纯化与复性
2.3.4 复性后蛋白含量的测定
2.3.5 有机磷降解酶(OpdA) 酶活力的测定与动力学分析
2.4 结果与分析
2.4.1 opdA 基因克隆及表达载体的构建
2.4.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化
2.4.3 纯化后蛋白含量的测定
2.4.4 复性后重组蛋白的活力测定与动力学分析
2.5 讨论
第三章 枯草芽孢杆菌的电转化条件的优化研究
3.1 引言
3.2 实验材料、仪器与试剂
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 试剂
3.2.3 培养基及有关溶液的配制
3.2.4 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1 培养基的配置
3.3.2 宿主菌 DH5α中抽提质粒 pHY300PLK
3.3.3 GM 培养基的优化
3.3.4 EM 培养基的优化
3.3.5 RM 培养基的优化
3.3.6 电击电压的优化
3.3.7 质粒浓度的优化
3.4 结果与分析
3.4.1 质粒 pHY300PLK 的提取
3.4.2 GM 培养基对电转化率的影响
3.4.3 EM 培养基对电转化率的影响
3.4.4 RM 培养基对电转化率的影响
3.4.5 电击电压对电转化率的影响
3.4.6 质粒浓度对电转化率的影响
3.5 讨论
第四章 有机磷降解酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达与酶学性质
4.1 引言
4.2 实验材料、仪器与试剂
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 试剂
4.2.3 培养基及有关溶液的配制
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 有机磷水解酶基因（opdA）枯草芽孢杆菌表达载体的构建
4.3.2 有机磷降解酶基因（opdA）在枯草芽孢杆菌中的诱导表达及其条件优化
4.4 结果和分析
4.4.1 opdA 基因克隆及表达载体的构建
4.4.2 重组菌株 WB800N/pHT43-opdA 的诱导表达及条件优化
4.4.3 重组蛋白含量的测定
4.4.4 有机磷降解酶（OpdA）酶活力的测定与动力学分析
4.4.5 诱导条件对有机磷降解酶（OpdA）酶活力的影响
4.4.6 有机磷降解酶（OpdA）的反应动力学分析
4.5 讨论
全文小结
参考文献
攻读硕士学位期间的论文及研究成果
致谢
本文编号：3788086
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 引言
1.2 降解有机磷农药的微生物及其降解酶的研究进展
1.2.1 降解有机磷农药的微生物
1.2.2 有机磷降解酶
1.2.3 有机磷降解酶编码基因
1.3 有机磷降解酶（OpdA）的简介
1.4 有机磷降解酶 OpdA 的作用机理
1.4.1 OpdA 活性位点与金属配位
1.4.2 OpdA 的作用机制
1.5 大肠杆菌表达系统的研究进展
1.6 食品级表达系统
1.7 枯草芽孢杆菌分泌表达系统的研究进展
1.8 立文依据与研究内容
第二章 有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌中的高效表达与酶学研究
2.1 引言
2.2 实验材料、仪器与试剂
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 试剂
2.2.3 培养基及有关溶液的配制
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 有机磷降解酶基因（opdA）大肠杆菌表达载体的构建
2.3.2 有机磷降解酶基因（opdA）在大肠杆菌 BL21 中诱导表达及条件的优化
2.3.3 OpdA 重组蛋白的纯化与复性
2.3.4 复性后蛋白含量的测定
2.3.5 有机磷降解酶(OpdA) 酶活力的测定与动力学分析
2.4 结果与分析
2.4.1 opdA 基因克隆及表达载体的构建
2.4.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化
2.4.3 纯化后蛋白含量的测定
2.4.4 复性后重组蛋白的活力测定与动力学分析
2.5 讨论
第三章 枯草芽孢杆菌的电转化条件的优化研究
3.1 引言
3.2 实验材料、仪器与试剂
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 试剂
3.2.3 培养基及有关溶液的配制
3.2.4 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1 培养基的配置
3.3.2 宿主菌 DH5α中抽提质粒 pHY300PLK
3.3.3 GM 培养基的优化
3.3.4 EM 培养基的优化
3.3.5 RM 培养基的优化
3.3.6 电击电压的优化
3.3.7 质粒浓度的优化
3.4 结果与分析
3.4.1 质粒 pHY300PLK 的提取
3.4.2 GM 培养基对电转化率的影响
3.4.3 EM 培养基对电转化率的影响
3.4.4 RM 培养基对电转化率的影响
3.4.5 电击电压对电转化率的影响
3.4.6 质粒浓度对电转化率的影响
3.5 讨论
第四章 有机磷降解酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达与酶学性质
4.1 引言
4.2 实验材料、仪器与试剂
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 试剂
4.2.3 培养基及有关溶液的配制
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 有机磷水解酶基因（opdA）枯草芽孢杆菌表达载体的构建
4.3.2 有机磷降解酶基因（opdA）在枯草芽孢杆菌中的诱导表达及其条件优化
4.4 结果和分析
4.4.1 opdA 基因克隆及表达载体的构建
4.4.2 重组菌株 WB800N/pHT43-opdA 的诱导表达及条件优化
4.4.3 重组蛋白含量的测定
4.4.4 有机磷降解酶（OpdA）酶活力的测定与动力学分析
4.4.5 诱导条件对有机磷降解酶（OpdA）酶活力的影响
4.4.6 有机磷降解酶（OpdA）的反应动力学分析
4.5 讨论
全文小结
参考文献
攻读硕士学位期间的论文及研究成果
致谢
本文编号：3788086
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