天然抗氧化剂对节球藻毒素诱导的鱼体免疫细胞毒效应的保护作用及机理研究

发布时间：2024-01-25 15:13

　　节球藻毒素是泡沫节球藻的次级代谢产物,广泛分布于蓝藻水华爆发水域,能损害鱼类免疫系统,影响鱼类正常的生理机能,对鱼类生存造成危害。本研究选用藻食性鲤科鲫鱼(Carassius auratus)为材料,采用离体细胞培养体外诱导方法,通过流式细胞仪凋亡率测定、共聚焦激光显微镜和透射电镜细胞结构观察、琼脂糖凝胶电泳DNA-Ladder检测技术研究节球藻毒素对鱼体免疫细胞的毒效应。在此基础上,深入研究了节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞毒性的分子机理。 共聚焦激光显微镜实验结果表明,空白组细胞核质呈现出均匀的荧光,节球藻毒素诱导组的细胞则表现为颗粒状荧光碎片。透射电镜实验结果展示了节球藻毒素暴露后的鲫鱼淋巴细胞呈现的典型细胞凋亡形态学特征,处理组细胞浆内空泡增多,细胞胞质浓缩,胞核染色质发生凝集等现象,对照组细胞则表现为细胞形态规则,核染色质分布均匀。琼脂糖凝胶电泳实验和流式细胞仪检测结果均显·示,节球藻毒素可诱导细胞DNA片段化,分别出现典型的细胞凋亡特征DNA-Ladder和亚二倍体峰；1、5、10、100μg/L节球藻毒素处理12h后,淋巴细胞凋亡率分别达到15.76%、17.36%、20.34%...

【文章页数】：95 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
插图和附表清单
目录
第一章 藻毒素对鱼的毒效应研究进展
    1.1 藻毒素的污染化学特征
    1.2 藻毒素对鱼类的生态毒效应
        1.2.1 肝肾毒性
        1.2.2 免疫毒性
        1.2.3 发育生殖毒性
        1.2.4 遗传毒性
    1.3 天然抗氧化剂介导的解毒机理研究
        1.3.1 藻毒素介导的细胞氧化应激作用
        1.3.2 槲皮素
        1.3.3 原花青素
        1.3.4 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)
    1.4 本文研究目标和研究思路
        1.4.1 研究目标
        1.4.2 研究思路
第二章 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞的凋亡毒效应研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 试剂和毒素
        2.2.2 试验鱼种
        2.2.3 试验仪器
        2.2.4 淋巴细胞分离与诱导
        2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
        2.2.6 共聚焦激光显微镜观察细胞凋亡
        2.2.7 透射电镜观察细胞凋亡
        2.2.8 DNA-Ladder检测细胞凋亡
        2.2.9 数据分析
    2.3 结果
        2.3.1 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡流式细胞仪检测
        2.3.2 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡共聚焦激光显微镜观察
        2.3.3 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡透射电镜观察
        2.3.4 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡DNA-Ladder检测
    2.4 讨论
    2.5 结论
第三章 节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡的分子机理研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 试剂和毒素
        3.2.2 试验鱼种
        3.2.3 试验仪器
        3.2.4 淋巴细胞分离与诱导
        3.2.5 流式细胞仪检测胞内钙离子变化规律
        3.2.6 流式细胞仪检测胞内ROS变化规律
        3.2.7 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化规律
        3.2.8 Caspase3/8/9活性测定
        3.2.9 Bax/Bcl-2基因表达测定
        3.2.10 Bax/Bcl-2蛋白表达测定
        3.2.12 数据分析
    3.3 结果
        3.3.1 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞内钙离子的影响
        3.3.2 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞内ROS的影响
        3.3.3 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞线粒体膜电位的影响
        3.3.4 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞内Caspase-3/8/9活性的影响
        3.3.5 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞内Bax/Bcl-2基因表达影响
        3.3.6 节球藻毒素对鲫鱼淋巴细胞内Bax/Bcl-2蛋白表达影响
    3.4 讨论
    3.5 结论
第四章 EGCG对节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞毒性的抑制作用研究
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 试剂和毒素
        4.2.2 试验鱼种
        4.2.3 试验仪器
        4.2.4 淋巴细胞分离与诱导
        4.2.5 流式细胞仪检测胞内ROS变化规律
        4.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法测定
        4.2.7 过氧化氢酶(CAT)活性测定
        4.2.8 微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定
        4.2.9 微量丙二醛(MDA)测定试剂盒
        4.2.10 数据分析
    4.3 结果
        4.3.1 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内ROS含量影响
        4.3.2 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内SOD活性影响
        4.3.3 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内CAT活性影响
        4.3.4 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内GSH含量影响
        4.3.5 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内MDA水平影响
    4.4 讨论
    4.5 结论
第五章 EGCG对节球藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡的抑制机理研究
    5.1 前言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 试剂和毒素
        5.2.2 试验鱼种
        5.2.3 试验仪器
        5.2.4 淋巴细胞分离与诱导
        5.2.5 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化规律
        5.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率
        5.2.7 Westem blot蛋白表达测定
        5.2.8 数据分析
    5.3 结果
        5.3.1 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞线粒体膜电位的影响
        5.3.2 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞凋亡率的影响
        5.3.3 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内bax/bcl-2蛋白表达的影响
        5.3.4 EGCG对节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞内Caspase-3蛋白表达的影响
    5.4 讨论
    5.5 结论
第六章 研究结论、创新点与展望
    6.1 研究结论
    6.2 创新点
    6.3 展望
参考文献
作者简历



本文编号：3885051