Rhodococcus sp.R04羟基联苯1，2-双加氧酶多样性及其功能研究

发布时间：2024-02-13 19:33

　　联苯的氯代衍生物多氯联苯(PCBs)是广泛应用的重要工业原料。它是一种严重的环境污染物,对人类有致癌作用。多氯联苯的微生物好氧降解是通过联苯代谢途径进行的。联苯的上游代谢途径需要四个酶的参与,其中2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)属于外部双加氧酶的一种,它在联苯和多氯联苯的降解中是一个非常关键的酶,其结构,功能和底物特异性等方面已成为该领域研究的热点。 Rhodococcus sp. R04基因组测序发现,该基因组中含有8个bphC基因,分别命名为bphCl至bphC8。基于氨基酸序列的相似性和外部双加氧酶的分类,BphCl, BphC2, BphC3, BphC8属于类型I, BphC4, BphC5, BphC6, BphC7属于类型Ⅱ。8个BphC之间的氨基酸序列相似性为11%～77%。根据全基因组序列设计引物,从Rhodococcus sp. R04基因组中扩增出8个bphC基因,将它们分别克隆到表达载体pBV220-His中,并获得了表达。用离子交换一步层析,获得了电泳纯的BphC8, SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为35KD左右的同源六聚体。最适温...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 2,3-二羟基联苯双加氧酶的概况
        1.1 双加氧酶概述
        1.2 外部双加氧酶的分类
        1.3 2,3-二羟基联苯双加氧酶的结构
        1.4 2,3-二羟基联苯双加氧酶的催化机制
    2 2,3-二羟基联苯双加氧酶的多样性
        2.1 不同微生物中BphC的多样性和功能
        2.2 BphC的一级结构比较
        2.3 BphC的二级结构比较
    3 2,3-二羟基联苯双加氧酶的聚合形态
        3.1 不同菌种中BphC的聚合形态
        3.2 包涵体组成成分
        3.3 包涵体形成原因
        3.4 包涵体特点
        3.5 包涵体研究进展
    4 本论文研究的目的和意义
    参考文献
第二章 Rhodococcus sp.R04中2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶多样性
    1 材料
        1.1 菌株和载体
        1.2 培养基
        1.3 主要的酶和化学试剂
        1.4 主要仪器设备
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04中8个BphC基因的序列分析
        2.2 Rhodococcus sp.R04中8个BphC一级结构序列比对
        2.3 建立系统发育树
        2.4 Rhodococcus sp.R04中8个BphC基因的克隆
        2.5 8个BphC基因的表达
    3 结果
        3.1 Rhodococcus sp.R04中8个BphC基因的序列分析
        3.2 Rhodococcus sp.R04中8个BphC一级结构序列比对分析
        3.3 BphC系统发育分析
        3.4 Rhodococcus sp.R04中8个BphC基因的扩增及重组子的鉴定
        3.5 8个BphC的表达
    4 讨论
    参考文献
第三章 具有活性的BphC2包涵体及其生化特性
    1 材料
        1.1 菌株和载体
        1.2 培养基
        1.3 主要的酶和化学试剂
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04中2,3-二羟基联苯双加氧酶基因bphC2的克隆
        2.2 BphC2的表达
        2.3 可溶性BphC2的纯化
        2.4 包涵体的纯化
        2.5 酶活及蛋白含量测定
        2.6 纯化的可溶性BphC2和包涵体的化学修饰
        2.7 纯化的可溶性BphC2和包涵体的热稳定性测定
        2.8 具有活性包涵体的酶活性与浊度测定
        2.9 HOPDA的荧光共谱扫描
        2.10 DeltaVision观察宿主菌中包涵体的位置
    3 结果
        3.1 Rhodococcus sp.R04中bphC2的扩增及重组子的鉴定
        3.2 BphC2的表达
        3.3 可溶性BphC2的纯化
        3.4 包涵体的纯化
        3.5 化学修饰剂对纯化的可溶性BphC2和包涵体酶活的影响
        3.6 纯化的可溶性BphC2和包涵体的热稳定性
        3.7 具有活性包涵体的酶活性与浊度的比值
        3.8 HOPDA的荧光共谱分析
        3.9 确定诱导后的宿主菌中包涵体的位置
    4 讨论
    参考文献
第四章 截短型BphC2的表达纯化和部分性质研究
    1 材料
        1.1 菌株和载体
        1.2 培养基
        1.3 主要的酶和化学试剂
    2 方法
        2.1 C-端截短型bphC2的克隆
        2.2 突变体重组质粒的构建
        2.3 C-端截短型BphC2的表达
        2.4 C-端截短型BphC2的纯化
        2.5 酶活性测定
        2.6 蛋白浓度测定
        2.7 突变酶的热稳定性测定
        2.8 突变酶寡聚体分析
    3 结果
        3.1 C-端截短型bphC2的克隆
        3.2 C-端截短型bphC2的表达
        3.3 C-端截短型BphC2的纯化
        3.4 野生型BphC2₂₉₅和突变酶的动力学常数
        3.5 突变酶的热稳定性变化
        3.6 突变酶的分子形式
    4 讨论
    参考文献
第五章 Rhodococcus sp.R04 BphC8的纯化和部分性质研究
    1 材料
        1.1 菌株和载体
        1.2 培养基
        1.3 主要化学试剂
    2 方法
        2.1 Rhodococcus sp.R04 BphC8的纯化
        2.2 最适pH和pH稳定性测定
        2.3 最适温度和热稳定性测定
        2.4 天然分子量的测定
        2.5 金属离子和某些化合物对BphC8酶活性的影响
        2.6 动力学参数的测定
        2.7 圆二色性分析
    3 结果与分析
        3.1 Rhodococcus sp.R04 BphC8的纯化
        3.2 BphC8最适pH和pH稳定性测定
        3.3 BphC8最适温度和热稳定性测定
        3.4 BphC8的天然分子量的测定
        3.5 金属离子和某些化合物对BphC8酶活性的影响
        3.6 BphC8对不同底物的动力学参数
        3.7 BphC8的圆二色性
        3.8 Rhodococcus sp.R04中三个BphC的比较
    参考文献
小结
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式



本文编号：3897089