汞特异性生物传感器的构建及表面展示金属硫蛋白对汞和镉的吸附
发布时间：2024-04-20 10:57
本研究利用组成型启动子ptet,汞诱导型启动子pmerR,表面展示冰晶核蛋白INP,镉的金属硫蛋白Mt3α,汞的金属结合蛋白MerR,以及作为荧光标记的加强型绿色荧光蛋白EGFP等,经基因工程技术构建融合基因ptet-inp-mt3a-egfp, ptet-inp-merR-egfp,及pmerR-inp-merR-egfp。 宿主细菌为恶臭假单胞菌X4,腐生型革兰氏阴性细菌,对环境的抗逆性很强,能够耐受并吸附汞和镉等重金属。将构建的融合基因插入到X4基因组,获得了3株工程菌株： X4-1:X4/(ptet-INP-Mt3α-EGFP)(组成型表达,吸附镉) X4-2:X4/(ptet-INP-MerR-EGFP)(组成型表达,吸附汞) X4-3:X4/(pmerR-INP-MerR-EGFP)(诱导性表达,汞检测和吸附) 通过在荧光显微镜下观察菌体验证了融合基因的正常表达,Western Blotting技术验证了融合蛋白展示到细胞膜表面。 随着细菌X4-1、X4-2的生长,融合蛋白的表达量也相应的增加,说明组成型启动子ptet稳定性好。X4-3在2μM汞离子条件下诱导2h就能达到较...
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略词(Abbreviation)
1 前言
1.1 重金属污染现状
1.1.1 重金属对生物体的毒性
1.1.2 中国重金属污染现状
1.2 土壤环境中重金属污染的治理方法
1.2.1 土壤重金属污染的修复方法
1.2.2 重金属污染的检测
1.3 细胞表面展示技术在重金属污染治理中的应用
1.3.1 金属硫蛋白的研究进展
1.3.2 细胞表面展示金属硫蛋白吸附重金属
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株和质粒
2.1.2 主要仪器
2.1.3 主要试剂
2.1.3.1 培养基
2.1.3.2 制备大肠杆菌感受态所需试剂
2.1.3.3 SDS-PAGE试剂
2.1.3.4 质粒抽提试剂
2.1.3.5 抗生素试剂
2.1.3.6 试剂盒和酶
2.2 实验方法
2.2.1 重组质粒的构建
2.2.1.1 质粒pVLT33-IMeE的构建
2.2.1.2 质粒pUC19-ptet-egfg的构建
2.2.1.3 质粒pUC19-pmerR-egfg的构建
2.2.1.4 质粒pTn-ptet-IMeE的构建
2.2.1.5 质粒pTn-ptet-IMtE的构建
2.2.1.6 质粒pTn-pmerR-IMeE的构建
2.2.2 基因克隆操作方法
2.2.2.1 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备(氯化钙法)
2.2.2.2 质粒的抽提
2.2.2.3 PCR聚合酶链式反应
2.2.2.4 双酶切体系
2.2.2.5 T4酶连体系
2.2.2.6 PCR及酶切产物的纯化
2.2.2.7 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
2.2.2.8 启动子ptet和pmerR特异性和灵敏性检测
2.2.2.9 两亲本杂交获得工程菌
2.2.3 工程菌株性能的测定
2.2.3.1 菌液荧光值的测定
2.2.3.2 工程菌株在荧光显微镜下的发光图
2.2.3.3 大肠杆菌细胞分级分离
2.2.3.4 Western Blotting实验步骤
2.2.3.5 工程菌生长曲线,荧光曲线的测定
2.2.3.6 工程菌X4-3在汞离子条件下诱导时间的确定
2.2.3.7 工程菌X4-3在汞离子诱导条件下的相对荧光值
2.2.3.8 工程菌汞离子和镉离子的耐受性
2.2.3.9 工程菌对镉和汞的吸附
2.2.3.10 工程菌在土壤中的定殖存活能力
2.2.3.11 工程菌在土壤中对镉和汞的修复能力
3 结果与分析
3.1 启动子ptet和pmerR特异性和灵敏性的检测
3.2 PCR验证工程菌的插入融合基因
3.3 工程菌株在荧光显微镜下的发光图
3.4 细胞分级分离以及Western Blotting结果
3.5 工程菌生长曲线和荧光曲线的测定
3.6 工程菌X4-3在汞离子条件下最佳诱导时间的确定
3.7 工程菌X4-3在不同浓度汞离子诱导下的相对荧光值
3.8 工程菌对汞离子和镉离子的耐受性
3.9 工程菌对镉和汞的吸附能力
3.10 工程菌在土壤中的定殖能力
4 讨论
参考文献
致谢
本文编号：3959311
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略词(Abbreviation)
1 前言
1.1 重金属污染现状
1.1.1 重金属对生物体的毒性
1.1.2 中国重金属污染现状
1.2 土壤环境中重金属污染的治理方法
1.2.1 土壤重金属污染的修复方法
1.2.2 重金属污染的检测
1.3 细胞表面展示技术在重金属污染治理中的应用
1.3.1 金属硫蛋白的研究进展
1.3.2 细胞表面展示金属硫蛋白吸附重金属
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株和质粒
2.1.2 主要仪器
2.1.3 主要试剂
2.1.3.1 培养基
2.1.3.2 制备大肠杆菌感受态所需试剂
2.1.3.3 SDS-PAGE试剂
2.1.3.4 质粒抽提试剂
2.1.3.5 抗生素试剂
2.1.3.6 试剂盒和酶
2.2 实验方法
2.2.1 重组质粒的构建
2.2.1.1 质粒pVLT33-IMeE的构建
2.2.1.2 质粒pUC19-ptet-egfg的构建
2.2.1.3 质粒pUC19-pmerR-egfg的构建
2.2.1.4 质粒pTn-ptet-IMeE的构建
2.2.1.5 质粒pTn-ptet-IMtE的构建
2.2.1.6 质粒pTn-pmerR-IMeE的构建
2.2.2 基因克隆操作方法
2.2.2.1 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备(氯化钙法)
2.2.2.2 质粒的抽提
2.2.2.3 PCR聚合酶链式反应
2.2.2.4 双酶切体系
2.2.2.5 T4酶连体系
2.2.2.6 PCR及酶切产物的纯化
2.2.2.7 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
2.2.2.8 启动子ptet和pmerR特异性和灵敏性检测
2.2.2.9 两亲本杂交获得工程菌
2.2.3 工程菌株性能的测定
2.2.3.1 菌液荧光值的测定
2.2.3.2 工程菌株在荧光显微镜下的发光图
2.2.3.3 大肠杆菌细胞分级分离
2.2.3.4 Western Blotting实验步骤
2.2.3.5 工程菌生长曲线,荧光曲线的测定
2.2.3.6 工程菌X4-3在汞离子条件下诱导时间的确定
2.2.3.7 工程菌X4-3在汞离子诱导条件下的相对荧光值
2.2.3.8 工程菌汞离子和镉离子的耐受性
2.2.3.9 工程菌对镉和汞的吸附
2.2.3.10 工程菌在土壤中的定殖存活能力
2.2.3.11 工程菌在土壤中对镉和汞的修复能力
3 结果与分析
3.1 启动子ptet和pmerR特异性和灵敏性的检测
3.2 PCR验证工程菌的插入融合基因
3.3 工程菌株在荧光显微镜下的发光图
3.4 细胞分级分离以及Western Blotting结果
3.5 工程菌生长曲线和荧光曲线的测定
3.6 工程菌X4-3在汞离子条件下最佳诱导时间的确定
3.7 工程菌X4-3在不同浓度汞离子诱导下的相对荧光值
3.8 工程菌对汞离子和镉离子的耐受性
3.9 工程菌对镉和汞的吸附能力
3.10 工程菌在土壤中的定殖能力
4 讨论
参考文献
致谢
本文编号：3959311
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/hetongwenben/3959311.html
