人乳寡糖2’-FL和3-FL的生物制备研究进展
发布时间：2022-01-02 11:27
人乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMO）是母乳中重要的免疫活性成分,对婴幼儿健康起到显著促进作用。2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）是HMO的主要组分,极具应用价值,3-岩藻糖基乳糖（3-FL）与2’-FL的合成途径相似,两者的研究具有相互借鉴意义,近年来针对它们的研究取得了较多进展。以微生物细胞工厂为核心理念的新型生物合成途径有望将2’-FL和3-FL产业化,未来将对乳制品行业产生重要的影响。文中综述了生物技术制备2’-FL和3-FL的最新研究进展,并对未来发展趋势进行了展望。
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(12)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
2’-FL和3-FL的结构示意图
纯酶催化仅限于实验室小规模研究，产业化应用还需要将关键酶基因构建到底盘微生物中来完成。已知的合成途径包括Salvage和De novo两种(图2)，其中Salvage途径需要外源添加L-岩藻糖作为合成前体；De novo途径则直接利用D-葡萄糖或甘油为碳源来合成关键前体GDP-L-岩藻糖，进而生产出人乳寡糖。2006年，法国国家科研中心的Drouillard等[15]首次在大肠杆菌中构建出2’-FL合成途径，表达了幽门螺杆菌Fut C酶基因，最高产量达到14 g/L，其中胞外含量11 g/L。这是首次采用De novo途径，该途径成为研究的焦点，Lee等[16]在E.coli BL21 star(DE3)菌株中表达了幽门螺杆菌来源的Fuc T2酶以及Man B、Man C、Gmd、Wca G酶，但该菌株分解乳糖的能力较强，因此难以大量积累2’-FL。更换无法水解乳糖的E.coli JM109(DE3)后，乳糖仅被用于合成2’-FL，产量上升到1.2 g/L，但仅为理论产量的20%。此外，作者发现Fuc T2表达后可溶性很差，多为包涵体，因此解决该酶的可溶性问题将提高2’-FL的合成能力。例如，Chin等[17]在其N端融合了3个天冬氨酸(D3标签)，使得酶可溶性提升，酶活力提高了3.4倍，这种添加负电荷氨基酸标签的方式早先也被用于提高脂肪酶在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了较好的效果，因而具备一定的普适性。由于E.coli JM109(DE3)菌株存在一些产业化应用的缺陷，包括生长缓慢、易产乙酸、易形成生物膜等，Chin等[18]尝试使用BL21 star(DE3)菌株，他们使用λ-Red重组技术改造了乳糖操纵子，使得BL21 star(DE3)水解乳糖的能力下降了97%，解决了乳糖易被宿主分解的问题。尽管最终产量并不如JM109(DE3)，但每克乳糖对应的2’-FL产率提高了3.6倍。最终通过分批发酵实现了2’-FL产量6.4 g/L，最高细胞干重71.1 g/L，产率0.118 g/(L·h)。Huang等[11]对不同的大肠杆菌宿主进行了比较，结果表明对2’-FL而言JM109(DE3)产量最高，对3-FL而言JM109(DE3)和Nova Blue(DE3)产量最高，而这两种宿主都不能利用乳糖，因此避免了乳糖分解。另一方面，加强乳糖的转运能力对提高2’-FL产量有较大帮助，已有报道通过表达乳酸克鲁维酵母来源的乳糖转运蛋白基因lac12来实现该目标。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳寡糖体外合成研究进展[J]. 翟娅菲,禹晓,相启森,张华,张星稀,申瑞玲. 食品工业科技. 2018(05)
[2]欧盟批准乳糖-N-新四糖等作为新食品成分使用[J]. 中国食品卫生杂志. 2016(02)
本文编号：3564093
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(12)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
2’-FL和3-FL的结构示意图
纯酶催化仅限于实验室小规模研究，产业化应用还需要将关键酶基因构建到底盘微生物中来完成。已知的合成途径包括Salvage和De novo两种(图2)，其中Salvage途径需要外源添加L-岩藻糖作为合成前体；De novo途径则直接利用D-葡萄糖或甘油为碳源来合成关键前体GDP-L-岩藻糖，进而生产出人乳寡糖。2006年，法国国家科研中心的Drouillard等[15]首次在大肠杆菌中构建出2’-FL合成途径，表达了幽门螺杆菌Fut C酶基因，最高产量达到14 g/L，其中胞外含量11 g/L。这是首次采用De novo途径，该途径成为研究的焦点，Lee等[16]在E.coli BL21 star(DE3)菌株中表达了幽门螺杆菌来源的Fuc T2酶以及Man B、Man C、Gmd、Wca G酶，但该菌株分解乳糖的能力较强，因此难以大量积累2’-FL。更换无法水解乳糖的E.coli JM109(DE3)后，乳糖仅被用于合成2’-FL，产量上升到1.2 g/L，但仅为理论产量的20%。此外，作者发现Fuc T2表达后可溶性很差，多为包涵体，因此解决该酶的可溶性问题将提高2’-FL的合成能力。例如，Chin等[17]在其N端融合了3个天冬氨酸(D3标签)，使得酶可溶性提升，酶活力提高了3.4倍，这种添加负电荷氨基酸标签的方式早先也被用于提高脂肪酶在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了较好的效果，因而具备一定的普适性。由于E.coli JM109(DE3)菌株存在一些产业化应用的缺陷，包括生长缓慢、易产乙酸、易形成生物膜等，Chin等[18]尝试使用BL21 star(DE3)菌株，他们使用λ-Red重组技术改造了乳糖操纵子，使得BL21 star(DE3)水解乳糖的能力下降了97%，解决了乳糖易被宿主分解的问题。尽管最终产量并不如JM109(DE3)，但每克乳糖对应的2’-FL产率提高了3.6倍。最终通过分批发酵实现了2’-FL产量6.4 g/L，最高细胞干重71.1 g/L，产率0.118 g/(L·h)。Huang等[11]对不同的大肠杆菌宿主进行了比较，结果表明对2’-FL而言JM109(DE3)产量最高，对3-FL而言JM109(DE3)和Nova Blue(DE3)产量最高，而这两种宿主都不能利用乳糖，因此避免了乳糖分解。另一方面，加强乳糖的转运能力对提高2’-FL产量有较大帮助，已有报道通过表达乳酸克鲁维酵母来源的乳糖转运蛋白基因lac12来实现该目标。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳寡糖体外合成研究进展[J]. 翟娅菲,禹晓,相启森,张华,张星稀,申瑞玲. 食品工业科技. 2018(05)
[2]欧盟批准乳糖-N-新四糖等作为新食品成分使用[J]. 中国食品卫生杂志. 2016(02)
本文编号：3564093
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/jieribaike/3564093.html
