松墨天牛漆酶基因MaLac1的克
发布时间：2021-10-19 13:48
【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta （DE3）使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段（低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫）肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列（GenBank登录号:KY073340）。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨...
【文章来源】：昆虫学报. 2020,63(04)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
邻接法构建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆虫Lac氨基酸序列的系统发育树(1 000次重复)
qPCR结果显示,MaLac1基因在松墨天牛肠道中广泛表达,转录水平在不同发育阶段存在显著差异(F=6.82, P<0.05)。松墨天牛低龄幼虫和老熟幼虫肠道中MaLac1的表达水平相近,均显著低于成虫的(P<0.05);在松墨天牛的蛹期肠道中,MaLac1的表达量增加,但仍显著低于成虫期的(P<0.05);在松墨天牛的成虫期,MaLac1在雌成虫肠道中的表达量略高于雄成虫的,均显著高于幼虫期和蛹期的(P<0.05)(图4)。图4 MaLac1在不同发育阶段松墨天牛肠道中的表达分析
根据课题组前期获得的松墨天牛转录组测序数据(Wu et al., 2016),筛选出松墨天牛漆酶保守序列信息,设计并合成引物。提取松墨天牛新鲜肠道组织总RNA(图1: A),逆转录合成cDNA作为模板,PCR扩增后得到该基因中间片段。根据获得的松墨天牛漆酶基因保守序列分别设计目的基因的5′和3′RACE特异引物,进行PCR扩增克隆测序。根据中间片段序列、5′RACE和3′RACE结果进行序列拼接,获得一条总长为2 395 bp的cDNA序列,其中编码区长度为2 067 bp(图1: B),5′端非编码区118 bp(图1: C),3′端非编码区210 bp(图1: D),命名此基因为MaLac1(GenBank登录号: KY073340)。MaLac1基因编码一个含688个氨基酸的蛋白质,编码蛋白分子量为78.34 kD,等电点为5.30。 信号肽预测结果表明,N端第1-15位氨基酸为信号肽区。MaLac1基因编码多肽的原子组成为C3500H5306N940O1042S35,不稳定系数是31.66,稳定性强。MaLac1基因的编码蛋白有80.15的脂肪系数,总平均亲水性为-0.314,通过软件ProtParam分析表明,MaLac1基因的编码蛋白亲水区域较多,为亲水性蛋白。利用在线TMpred软件对 MaLac1基因编码蛋白进行跨膜区分析,结果表明MaLac1基因编码蛋白具有2个跨膜域和1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域有17～18个氨基酸残基。使用SOPMA等软件和Swiss-model软件分析MaLac1基因编码蛋白质结构,结果表明MaLac1编码蛋白二级结构中无规则卷曲占比57.99%,α-螺旋占比9.3%,β-折叠占比5.23%,α-螺旋与无规则卷曲间的伸展链占比27.47%,表明三级结构中构成蛋白质的主要骨架为无规则卷曲。2.2 松墨天牛MaLac1蛋白与其他已知昆虫漆酶基因序列比对及系统进化分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]松墨天牛成虫行为与化学生态学研究进展[J]. 史先慧,马涛,陆雪雷,沈婧,孙朝辉,温秀军,邓培雄. 林业科学研究. 2017(05)
[2]单宁酸对红、绿色型豌豆蚜生长发育及繁殖的影响[J]. 邵娅,王森山,叶超. 草地学报. 2017(04)
[3]松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选[J]. 冯波,郭前爽,毛必鹏,杜永均. 昆虫学报. 2016(04)
[4]昆虫漆酶的研究进展[J]. 于孟兰,倪金凤. 生物加工过程. 2014(01)
[5]中国松材线虫病研究[J]. 张锴,梁军,严冬辉,张星耀. 世界林业研究. 2010(03)
[6]中国松材线虫病空间分布格局[J]. 潘宏阳,叶建仁,吴小芹. 生态学报. 2009(08)
[7]木材白腐菌分解木质素的酶系统-锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制[J]. 池玉杰,伊洪伟. 菌物学报. 2007(01)
[8]松墨天牛生物学特性的研究[J]. 王玲萍. 福建林业科技. 2004(03)
[9]松材线虫及其关键传媒墨天牛的研究进展[J]. 宁眺,方宇凌,汤坚,孙江华. 昆虫知识. 2004(02)
博士论文
[1]肚倍蚜适应单宁环境机理的初步研究[D]. 李芒.华中农业大学 2011
本文编号：3444986
【文章来源】：昆虫学报. 2020,63(04)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
邻接法构建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆虫Lac氨基酸序列的系统发育树(1 000次重复)
qPCR结果显示,MaLac1基因在松墨天牛肠道中广泛表达,转录水平在不同发育阶段存在显著差异(F=6.82, P<0.05)。松墨天牛低龄幼虫和老熟幼虫肠道中MaLac1的表达水平相近,均显著低于成虫的(P<0.05);在松墨天牛的蛹期肠道中,MaLac1的表达量增加,但仍显著低于成虫期的(P<0.05);在松墨天牛的成虫期,MaLac1在雌成虫肠道中的表达量略高于雄成虫的,均显著高于幼虫期和蛹期的(P<0.05)(图4)。图4 MaLac1在不同发育阶段松墨天牛肠道中的表达分析
根据课题组前期获得的松墨天牛转录组测序数据(Wu et al., 2016),筛选出松墨天牛漆酶保守序列信息,设计并合成引物。提取松墨天牛新鲜肠道组织总RNA(图1: A),逆转录合成cDNA作为模板,PCR扩增后得到该基因中间片段。根据获得的松墨天牛漆酶基因保守序列分别设计目的基因的5′和3′RACE特异引物,进行PCR扩增克隆测序。根据中间片段序列、5′RACE和3′RACE结果进行序列拼接,获得一条总长为2 395 bp的cDNA序列,其中编码区长度为2 067 bp(图1: B),5′端非编码区118 bp(图1: C),3′端非编码区210 bp(图1: D),命名此基因为MaLac1(GenBank登录号: KY073340)。MaLac1基因编码一个含688个氨基酸的蛋白质,编码蛋白分子量为78.34 kD,等电点为5.30。 信号肽预测结果表明,N端第1-15位氨基酸为信号肽区。MaLac1基因编码多肽的原子组成为C3500H5306N940O1042S35,不稳定系数是31.66,稳定性强。MaLac1基因的编码蛋白有80.15的脂肪系数,总平均亲水性为-0.314,通过软件ProtParam分析表明,MaLac1基因的编码蛋白亲水区域较多,为亲水性蛋白。利用在线TMpred软件对 MaLac1基因编码蛋白进行跨膜区分析,结果表明MaLac1基因编码蛋白具有2个跨膜域和1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域有17～18个氨基酸残基。使用SOPMA等软件和Swiss-model软件分析MaLac1基因编码蛋白质结构,结果表明MaLac1编码蛋白二级结构中无规则卷曲占比57.99%,α-螺旋占比9.3%,β-折叠占比5.23%,α-螺旋与无规则卷曲间的伸展链占比27.47%,表明三级结构中构成蛋白质的主要骨架为无规则卷曲。2.2 松墨天牛MaLac1蛋白与其他已知昆虫漆酶基因序列比对及系统进化分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]松墨天牛成虫行为与化学生态学研究进展[J]. 史先慧,马涛,陆雪雷,沈婧,孙朝辉,温秀军,邓培雄. 林业科学研究. 2017(05)
[2]单宁酸对红、绿色型豌豆蚜生长发育及繁殖的影响[J]. 邵娅,王森山,叶超. 草地学报. 2017(04)
[3]松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选[J]. 冯波,郭前爽,毛必鹏,杜永均. 昆虫学报. 2016(04)
[4]昆虫漆酶的研究进展[J]. 于孟兰,倪金凤. 生物加工过程. 2014(01)
[5]中国松材线虫病研究[J]. 张锴,梁军,严冬辉,张星耀. 世界林业研究. 2010(03)
[6]中国松材线虫病空间分布格局[J]. 潘宏阳,叶建仁,吴小芹. 生态学报. 2009(08)
[7]木材白腐菌分解木质素的酶系统-锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制[J]. 池玉杰,伊洪伟. 菌物学报. 2007(01)
[8]松墨天牛生物学特性的研究[J]. 王玲萍. 福建林业科技. 2004(03)
[9]松材线虫及其关键传媒墨天牛的研究进展[J]. 宁眺,方宇凌,汤坚,孙江华. 昆虫知识. 2004(02)
博士论文
[1]肚倍蚜适应单宁环境机理的初步研究[D]. 李芒.华中农业大学 2011
本文编号：3444986
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