柳枝稷幼穗再生体系建立与八倍体诱导研究

发布时间：2016-04-25 10:41

第一章  绪论

1.1  引言
观赏草（Ornamental Grass）是指具有观赏价值的草本植物，在园林景观中是种用途多而广的重要造景材料（井渌，2012）。以禾本科（Gramineae）居多，其中莎草科（Cyperaceae）、香蒲科（Typhaceae）、灯心草科（Juncaceae）、鸢尾科（Iridaceae）、百合科（Liliaceae）、天南星科（Araceae）、木贼科（Equisetaceae）等科属中一些具有观赏价值的草本植物及竹亚科（Bambusoideae）中低矮、小型的观赏竹也在其范围内（武菊英，2007）。观赏草品种多样种类丰富，株型奇特，叶色质地多样，花序独具特色，具有很高的观赏价值，而且相较于其他园林绿化材料，观赏草养护简单、耐湿、抗旱、抗逆性强，因此在构建节约型园林和生态型园林中发挥着重要的作用（袁小环，2015）。 20 世纪中期，观赏草兴起于欧美等国，其独特的美感、自然的风格和低廉的养护成本，使观赏草迅速发展，在美国、加拿大、澳大利亚等已经有了相对成熟的观赏草产业链（约翰﹒雷纳  等，2008；南茜 J 安德拉  等，2009）。目前，观赏草已成为欧美国家进行环境美化、景观绿化、生态改善、水土保持中的一类常规园林植物材料，展现了极富野趣的自然特质（武菊英  等，2003；刘宗华  等，2008）。 我国相对欧美国家来讲，在观赏草的研究应用方面时间较短，还有待进一步完善和发展。国内观赏草最早是在 20 世纪 90 年代中后期由当时任职于上海植物园的刘昆良引入国内试种并进行商业应用，2000 年完成了上海市园林局设立的―观赏草引种示范研究‖课题（王燕艳  等，2009）。北京市农林科学院草业与环境研究发展中心在观赏草研究方面开展也较早，该单位 2003 年初承担了“观赏草资源引进、筛选、扩繁和应用技术研究”，开始收集和统计国内的观赏草资源，并且将一批优良的观赏草品种应用在北京园林景观中（唐颖，2012）。我国观赏草资源非常丰富，国内高校、科研单位及北京、上海、杭州、宁波等城市的公司相继开展了观赏草的研究与培育工作。
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1.2  研究的目的与意义
我国对于柳枝稷的研究主要集中在其生态适应性、生态功能、生物产量、品质等方面，在观赏品种选育与园林应用方面的研究刚刚起步。作为引种植物，柳枝稷在国内种质资源非常有限，而且种植品种较为单一，因此在现有资源的基础上进行种质创新与品种选育尤为重要。 本研究以不同柳枝稷品种的幼穗为研究材料，通过组织培养技术建立其再生技术体系，通过探讨不同品种间的组培差异，筛选出优良的组培品种，并采用秋水仙素优良的组培品种进行多倍体诱导研究，以期获得柳枝稷同源多倍体材料，为今后柳枝稷的品种选育、开发和利用提供新的种质资源。 
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第二章  柳枝稷再生体系的建立

2.1  实验材料与研究方法

选取柳枝稷三种生态型的八个品种：Alamo、Kanlow、Blackwell、Trailblazer、Forestburg、Pathfinder、NewYork、Cave-in-rock（表 2-1）。均来自北京草业与环境研究发展中心（国家非粮生物质研究中心北京分中心）小汤山基地资源圃。该资源圃地理坐标位于东经 116°29′，北纬 40°17′，属暖温带，半湿润大陆性季风气候。5 月下旬至 6 中旬，当柳枝稷生长至孕穗期时，将含苞未成熟幼穗的生殖枝剪下，用保鲜膜包裹置于冰盒内带回实验室，放在 4℃冰箱冷藏保存。使用时先剥去外层苞叶和叶鞘，然后用手术刀切取含内层苞叶的幼穗，将其切成 2 cm 左右小段，置于超净工作台上。 用 75%乙醇对幼穗进行表面消毒 30 s，无菌蒸馏水冲洗 2 次后，再用 20% NaClO 灭菌 10  min，最后用无菌蒸馏水洗涤 3-4 次，放置在灭菌滤纸上，吸干表面水分。将幼穗切成 1 cm 左右的小段，并将幼穗其纵切两半，留取最内层苞叶与幼穗，接种于诱导培养基中。每个培养皿放  6 个幼穗，每个品种放 6 个培养皿。

 

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2.2  结果与分析
将幼穗接入培养基中，随时间推移幼穗膨大，逐渐散开，颜色变暗，中途继代一次剥掉所有苞叶，约  2 周后在膨大处开始长出白色愈伤组织，愈伤逐渐膨大后可继代移除老化的幼穗。 启动期是愈伤组织形成的起点，是细胞正准备分裂的时期，外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化的启动器进入分裂期，开始形成愈伤组织（尹伟伦 等，2009）。启动期的长短与植物的种类、外植体的生理状况、激素种类及外部环境有关。不同柳枝稷品种在启动时间上各不相同，其中 Alamo 和 Trailblazer 在启动时间上较早，约为 14 d，其次依次是 Blackwell、Cave-in-rock、Forestburg、NewYork 和 Kanlow，Pathfinder启动时间最迟缓，达到 18 d（如下图 2-2 所示）。  柳枝稷品种 Alamo 在愈伤诱导率指标上表现最好，第 25  d 时诱导率就可达到 100%（图2-3）。其次是Trailblazer和Cave-in-rock，30 d 时诱导率达到100%。Kanlow和 Blackwell在 35  d 时诱导率能达到 100%。Forsetburg、NewYork 和 Pathfinder 诱导率相对较低，在35  d 时分别达到 91.66%、80.5%和 75%。研究结果表明，以幼穗为外植体柳枝稷愈伤组织的诱导率很高，但不同基因型之间存在较大差异。 
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第三章  柳枝稷的八倍体诱导 ...... 34 
3.1  实验材料与研究方法 ....... 34 
3.1.1  实验材料 ....... 34 
3.1.2  实验方法 ....... 34 
3.2  结果与分析 ...... 37 
3.3  小结 ...... 44 
第四章  结论与讨论 .... 46 
4.1  结论 ...... 46 
4.1.1  柳枝稷再生体系的建立 ...... 46 
4.1.2  柳枝稷的多倍体诱导 .... 46 
4.2  讨论 ...... 47 
4.2.1  柳枝稷外植体的选择.......47 
4.2.2  柳枝稷再生体系的建立.........47 
4.2.3  秋水仙素浓度的确定.......48 
4.2.4  多倍体鉴定.....48 
4.2.5  混倍体的产生.......49 
4.3  展望 ...... 49 


第三章  柳枝稷的八倍体诱导

3.1  实验材料与研究方法
称取 1 g 秋水仙素，先用少量蒸馏水溶解，待溶解完全后，用蒸馏水定容至 50 ml，，制备 2%  秋水仙素母液。在超净工作台内用注射器吸取秋水仙素溶液，插上一次性针头式过滤器，手推注射器实现过滤灭菌，灭菌完毕后放入 4℃  冰箱内避光保存备用。 将无菌秋水仙素溶液加入液体诱导培养基中，使培养基中秋水仙素的浓度分别为 0、0.04%、0.08%和 0.12%，然后将生长良好的柳枝稷愈伤组织分别接入，每个处理组处理六瓶，每瓶内放入约 3g 愈伤组织。在温度 25±2  ℃，黑暗条件震荡处理 24 h、48 h、72 h和 96 h 等不同时间（表 3-2），转速为 120 rpm/min。 处理完毕后用已灭菌的液体诱导培养基反复冲洗 2-3 次，用无菌滤纸将溶液吸干后转入分化培养基上诱导芽，观察愈伤生长及分化状况，并做数据记录。待诱导芽长至 1-2 cm，用手术刀切下转接至生根培养基诱导生根。 
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结论

本实验以两种生态型八个不同柳枝稷品种的幼穗为外植体，构建了柳枝稷再生体系，同时将愈伤启动时间、愈伤诱导率、增殖率、分化率、生根数目和生根条数等 6 个生长指标采用变异系数法来确定各个指标权重，综合评价这八个柳枝稷品种的再生能力差异。研究所得结论如下： 
（1）在柳枝稷再生体系的研究中，八个柳枝稷品种愈伤组织诱导及再生的表现均明显差异。Alamo 表现最好，其愈伤诱导启动时间最短，诱导率和分化率均最高； Cave-in-Rock 愈伤组织增殖率最高，再生苗平均根长最长；  Kanlow 再生苗根条数最多。 
（2）用变异系法来赋予 6 个指标的权重，可以得出诱导率、分化率、增殖率所占权重最大，加和为总权重的 74.95%，说明这三个指标是该体系的主要评价指标。对这八个品种进行再生体系能力进行综合评价，其再生能力大小依次为 Alamo > Cave-in-rock > Kanlow > NewYork > Forestburg > Trailblazer > Blackwell > Pathfinder；对其指标用欧氏距离分析法进行聚类分析，可将 8 个品种归为两类，第一类是 Alamo、Kanlow、Cave-in-rock、NewYork，第二类是 Blackwell、Forestburg、Trailblazer、Pathfinder，其中第一类较第二类更适合该再生体系。 
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参考文献(略)

本文编号：40840