巴氏葡萄球菌 TS-82 产类胡萝卜素裂解酶及其催化类胡萝卜素降解机理的研究

发布时间：2016-05-11 16:07

第一章 文献综述

1.1 类胡萝卜素的种类及其功能特性
类胡萝卜素是一类由植物和某些光合微生物产生的呈红色、橘黄色或者黄色的亲脂性异戊二烯类染料，一般在 300~600nm 之间有吸收峰。类胡萝卜素广泛存在于食物中，如蔬菜、水果和海鲜类等（Polyakov and Kispert 2015）。在自然状态下，类胡萝卜素的典型结构特点是高度不饱和，其最显著特征为含有 3~15 个共轭双键（Raisig andSandmann 2001），共轭双键存在的位置决定类胡萝卜素的各种理化性质。
1.1.1 类胡萝卜素种类

在自然界中已鉴定出天然类胡萝卜素的种类超过 700 种，其中典型的类胡萝卜素种类如图 1-1 所示。由于其种类很多，所以分类方法也有多种。若类胡萝卜素按长链 C 原子数量分类可分为：C30、C40、C50三大类，其中绝大部分类胡萝卜素是 C40类，而在甲基杆菌和葡萄球菌等细菌中会产生一些 C30类（刘晓瑞 2013）。若类胡萝卜素按长直链含有六元环的数目分类可分为：番茄红素类的直链类、β-阿朴-8'-胡萝卜醛类的单环类以及 β-胡萝卜素类的双环类胡萝卜素。如按照构成元素可分为两大类：一类是由 C、H 两种元素组成的环状或非环状结构的化合物，将其称为胡萝卜素类，这类化合物极性较小，典型代表为 β-胡萝卜素和番茄红素；一类是由 C、H、O 三大元素构成的化合物，称之为含氧类胡萝卜素，分子中含有氧原子，可形成羟基、甲氧基、羰基和环氧化物等（孙玉敬等 2012），极性较大，典型代表为叶黄素类（刘晓瑞 2013；Britton 1995）。图1-1 所示的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素、番茄红素属于胡萝卜素，而 β-阿朴-8'-胡萝卜醛、玉米黄质、角黄质和虾青素属于含氧类胡萝卜素；番茄红素属于直链，β-阿朴-8'-胡萝卜醛属于单环，而 β-胡萝卜素、玉米黄质、角黄质和虾青素属于双环类胡萝卜素。

1.1.2 功能特性
1.1.2.1 光吸收和光保护作用
在光合生物中类胡萝卜素是不可或缺的组分，有光吸收和光保护两方面的作用。类胡萝卜素可捕获可见光，然后将自身吸收的光能转化为电能，传递给叶绿素来增加光合效率（Cogdell and Thornber 1980），即为光吸收作用；类胡萝卜素以热的形式释放出单线态氧（高度活性）中的能量，从而使其变成基态氧，对光合生物有必不可少的保护作用（张岩岩和陈玉超 2009）。
1.1.2.2 细胞膜的抗氧化保护剂

在一些嗜极微生物中，类胡萝卜素多数位于细胞膜上，是组成膜结构的主要成分。经研究，类胡萝卜素各自特有的结构特征决定了其在细胞膜上的定位。只由 C、H 两元素构成的胡萝卜素类如 β-胡萝卜素和番茄红素等可完全进入细胞膜内部，同时具有流动性；而含氧类胡萝卜素由于其含有极性较大的取代基如羟基，可较大程度地影响类胡萝卜素在膜上的定位。不同的类胡萝卜素可与细胞膜结构上不同区域的基团起反应而作为细胞膜抗氧化保护剂，其中胡萝卜素类分子只与细胞膜的内部疏水层上的分子产生有效的反应；而含氧类胡萝卜素如玉米黄质，由于其极性较大，可穿入极性区而和水相中存在的自由基团发生反应（Bertram 2004）。

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1.2 类胡萝卜素裂解产物的种类及功能
类胡萝卜素除了上述功能外，还可作为一些派生物的重要底物。根据类胡萝卜素种类和裂解位置的不同，可生成多种衍生物，其在生物体中具有重要的功能，如可作为维生素、植物激素及芳香类化合物等。具体介绍如下：
1.2.1 维生素 A
类维生素 A（视黄醛、视黄醇和视黄酸）是一类重要的类胡萝卜素裂解产物，由含有一个及以上未被取代的 β-末端基团的 C40类胡萝卜素或含有 β-末端基团和含异戊二烯链足够长的阿朴类胡萝卜素（如 β-阿朴-8'-胡萝卜醛和 β-阿朴-10'-胡萝卜醛）在 C15-C15'双键位置断裂生成的化合物（Hoffmann et al. 2012），如图 1-2a 和 d（Kloer and Schulz2006）。维生素 A 在脊椎动物及细菌的视循环中有着至关重要的作用，可促进感光蛋白视紫红质的形成（Grote and O'Malley 2011；Spudich et al. 2000）。在动物领域，其他的类维生素 A 如（3, 4）-二脱氧维生素 A、（3R）-3-OH-维生素 A、（3S）-3-OH-维生素A、（4R）-4-OH-维生素 A 等也可作为视循环中的发色团（Seki et al. 1998）。当类维生素 A 含量不足时，会引发视力障碍、角膜软化及夜盲症等疾病（赵珺彦和陈启和 2009）。
所有的反式视黄醇可氧化为反式视黄酸，从而转化为 9-顺式异构体，这类物质属于核视黄酸（RAR）和视黄酸 X（RXR）感受器，因此在免疫缺陷病及癌症治疗中有着重要的作用（Abu et al. 2005；Simeone and Tari 2004；Spilianakis et al. 2005）。另外，维生素 A 还可促进食物中铁元素的吸收，并保持正常的上皮组织形态和功能，使皮肤保持湿润，避免粗糙、干燥及毛囊角质化（Heinrich et al. 2006）。
1.2.2 染料色素

若类胡萝卜素裂解产物保留有较多的共轭双键，则这类阿朴-类胡萝卜素可保有原类胡萝卜素色素的性质。藏红花呈现出亮橘红色的原因主要是（1）C20阿朴-类胡萝卜素藏花酸可降解生成配糖体（图 1-2a）；（2）C24阿朴-类胡萝卜素胭脂素可生成橘红色的胭脂红（图 1-2c）（Bouvier et al. 2003a）。由图 1-2c 可知，番茄红素在 C5-C6和 C5'-C6'双键位置同时断裂是合成色素胭脂素（bixin）的第一步（Bouvier et al. 2003a）。所以从胭脂树（Bixa orellana）种子中提取得到的胭脂素可广泛用作食品和化妆品的色素添加剂。

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第二章 巴氏葡萄球菌 TS-82 的特性及其产类胡萝卜素裂解酶的条件优化

葡萄球菌在自然界中无所不在，其中有些种类如金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及表皮葡萄球菌等，存在于食品中，可产生肠毒素（Greig et al. 2007）从而引发食物中毒（Rodriguez et al. 1996）。之前大部分研究集中关注于金黄色葡萄球菌的致病性，但是近年来有报道表明其他葡萄球菌属也会产生致病性（Mounier et al. 2006；Simeoni et al.2008）。所以研究食品源葡萄球菌的致病性是至关重要的。我们课题组在前期研究中发现并分离得到一株可以降解类胡萝卜素产香的微生物，经鉴定是凝固酶阴性的巴氏葡萄球菌，对其在液体培养基的研究结果表明该细菌产生的类胡萝卜素降解酶为胞外酶（王树林 2011）。因此，为了进一步了解该菌产类胡萝卜素裂解酶的能力，以期应用于果酒酿造及食品加工中，本章主要对该菌的特性进行研究，，并优化筛选出最佳产酶酶活的培养条件。

2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 菌株
实验室分离保存的巴氏葡萄球菌菌株 TS-82（GeneBank Accession No. KP171185）。
2.1.1.2 主要试剂和仪器
β-胡萝卜素标准品（98%），红霉素（E），阿米卡星（AM），利福平（RIF），万古霉素（VA），四环素（TET），氨苄青霉素（AMP），甲氧苄啶（TRI），氯霉素（C），甲氧西林（ME）：Sigma-Aldrich；0.1%（w/v）结晶紫，新鲜羊血琼脂培养基，胰蛋白胨大豆琼脂培养基，甲苯胺蓝-DNA 酶琼脂培养基，Baird-Parker 培养基：Solarbio；其他试剂均为国产分析纯试剂。
UV-2000 型紫外-可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；恒温震荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司；HH 恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；pH 计：上海精密科学仪器有限公司；水平层流单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司。
2.1.2 方法
2.1.2.1 培养基及培养条件

完全营养液体培养基：蔗糖 30g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3g/L，调 pH 至 7.0。固体培养基在液体培养基基础上添加琼脂 20g/L。121℃灭菌 20min 备用。在 37℃、130r/min 条件下培养。

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2.2 结果与分析
2.2.1 巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性测试结果
葡萄球菌广泛分布于自然界中，包括食品及其周围环境中。葡萄球菌中的很多种，如金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，能引发疾病（Rodriguez et al. 1996）。为了检测可降解类胡萝卜素巴氏葡萄球菌 TS-82 是否可安全应用于食品生产中，对其主要毒性因素进行测试，结果如表 2-1 所示。巴氏葡萄球菌 TS-82 在新鲜羊血（5%）平板上培养 24h 后在菌落周围未发现透明溶血环，表明其为溶血性阴性；TS-82 菌株不能使含有抗凝剂的兔血浆发生凝固，血浆没有发生改变，表明其为血浆凝固酶阴性；同样地，TS-82 菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养 24h 后未发现光圈，即未产生蛋白水解酶；TS-82 菌株在甲苯胺蓝-DNA 酶琼脂培养基上培养 24h 后未发现甲苯胺蓝变色反应，表明该菌株不产生 DNA 水解酶；TS-82 菌株在脂肪酶和卵磷脂酶的测定中未发现有不透明环的出现，表明其为阴性；TS-82 菌株可形成弱生物膜（A590=0.24）。以上结果都显示 TS-82 菌株未生成与毒素相关的酶，不具备致病性，可安全用于食品加工工业。
2.2.2 巴氏葡萄球菌 TS-82 的耐药性测试结果
细菌致病性的另一个主要特征是耐药性。TS-82 菌株在各抗生素的最低抑菌浓度下，37℃培养 24h 后观察菌体生长情况，发现该菌株只在含四环素培养基上显著生长，而在其他抗生素培养基上未生长，表明 TS-82 菌株只对四环素（TET）有耐药性，而对其他的抗生素均敏感（表 2-1）。与之前文献报道的巴氏葡萄球菌的耐药性相比（Marino et al.2011），TS-82 的耐药性明显低于其他菌株，而且该菌株对甲氧西林和万古霉素极其敏感，大大提高了该菌株在食品应用上的安全性，为该菌株及所产类胡萝卜素裂解酶作为生物香气的新型工具奠定基础。
2.2.3 培养条件对 TS-82 菌株生长及产酶活性的影响
2.2.3.1 培养时间对 TS-82 菌株生长及产酶活性的影响

如图 2-1 所示，在接种量 2%、37℃、130r/min 条件下，培养时间对 TS-82 菌株的生长及产酶酶活均有影响。在培养初期，随着培养时间的增加，菌株呈对数期生长，酶活较低；在 12~16h 时菌株基本进入稳定期，同时酶活也达到最大值；随着培养时间的延长，菌株 OD 值虽然不再变化，但是大部分菌株逐渐衰亡，产酶量减少，导致酶活下降。因此培养时间选择 16h。

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第三章 巴氏葡萄球菌 TS-82 类胡萝卜素裂解酶的分离纯化 ······34
3.1 材料与方法 ·························· 34
3.1.1 材料 ···························· 34
第四章 类胡萝卜素裂解酶酶学特性的研究 ··············45
4.1 材料与方法 ························ 45
4.1.1 材料 ··························· 45
4.1.2 方法 ··························· 45
4.2 结果与分析 ························· 48
第五章 类胡萝卜素裂解酶催化不同底物转化为非香气物质的条件及鉴定 ··63
5.1 材料与方法 ···························· 63
5.1.1 材料 ······························ 63

5.1.2 方法 ······························ 64

第六章 类胡萝卜素裂解酶催化不同底物降解产香气物质的测定及作用机理的探究

在第五章中提到类胡萝卜素裂解是生成香气化合物的重要途径，如 C13酮类 β-紫罗兰酮，由于其阈值低至 0.007ppm 而成为风味加工中重要的风味物质（Winterhalter andRouseff 2002），广泛用于食品加工、饮料饮品制作及化妆品行业中。同时 β-紫罗兰酮作为 C13类异戊二烯而言还具有一定的生物活性，可抑制癌细胞增殖、调控乳腺癌细胞、抗致畸毒性及降血脂等（孙向荣等 2008；Gurak et al. 2014；Liu et al. 2010）。然而 β-紫罗兰酮的提取工艺繁琐、昂贵且量微，所以生物技术手段在这些香气化合物的形成上备受关注，尤其是酶和微生物的生物催化作用（Shimoni et al. 2003）。因类胡萝卜素生物转化生成的香气化合物是“天然”添加剂而成为生产香气化合物的重要手段（Uenojo etal. 2007）。类胡萝卜素的生物转化可通过非特异性氧化或脂肪氧合酶氧化降解（Wu et al.1999），也可通过过氧化物酶（Zorn et al. 2003b）或类胡萝卜素裂解氧合酶特异性的催化双键裂解来实现（Schwartz et al. 2001）。类胡萝卜素裂解酶可催化许多双环及链状类胡萝卜素底物在 C9-C10和 C9'-C10'双键位置断裂产生一分子的 C14双醛和两分子衍生的C13酮类（Kloer and Schulz 2006）。由于类胡萝卜素裂解酶广泛的底物特异性，所以可生成多种 C13化合物，包括 α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、3-OH-β-紫罗兰酮、3-O-β-紫罗兰酮、假紫罗兰酮和香叶基丙酮等（Ilg et al. 2009）。

在上一章中，通过高效液相色谱及 HPLC-MS 鉴定得到底物裂解生成的非香气物质。通过非香气物质的信息初步推断该胡萝卜素裂解酶作用于类胡萝卜素底物的C9-C10/C9'-C10'双键位置。而文献报道类胡萝卜素在 C9-C10/C9'-C10'双键位置断裂可产生C13酮类化合物（Hoffmann et al. 2012），故本章在上一章试验条件的基础上，通过 GC-MS手段测定所得纯酶催化不同底物裂解生成的香气物质，并结合生成的香气物质与非香气物质来准确探究该类胡萝卜裂解酶的作用位点，揭示其催化机理。

6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.1.1 类胡萝卜素裂解酶纯酶的制备
参照 4.1.1.1 的方法制备纯酶粉，4℃保存待用。
6.1.1.2 试剂、仪器

β-紫罗兰酮，β-环柠檬醛购自 Acros-Organics（美国）；β-阿朴-8'-胡萝卜醛（98%）、β-胡萝卜素（98%）、玉米黄质（95%）、角黄质（95%）、虾青素（95%）购自 Sigma-Aldrich第七章 结论、创新点与展望7.1 结论（美国）；内标 3-辛醇购自北京百灵威试剂有限公司；丙酮购自陇南化学试剂公司；其他分析级试剂购自天津科密欧。

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第七章 结论、创新点与展望

7.1 结论
类胡萝卜素裂解酶是一类对类胡萝卜素具有催化作用，可将底物转为目标产物的生物酶类，因具有降解效率高、专一性强、催化条件温和、产物中目标产物含量高的特点而受到广泛关注。类胡萝卜素裂解酶不仅存在于植物、昆虫、哺乳类动物中，也存在于部分微生物中，如真菌、变形细菌和光合细菌等。然而，目前有关葡萄球菌及其所产类胡萝卜素裂解酶的研究甚少。本课题组在沙棘酒前期发酵过程中，分离得到一株高效降解类胡萝卜素的微生物 TS-82，经鉴定为巴氏葡萄球菌。为完善类胡萝卜素的降解途径、开发巴氏葡萄球菌 TS-82 的新功能、揭示类胡萝卜素裂解酶的催化机理，论文以高效降解类胡萝卜素的 S.pasteuri TS-82 为对象，研究其致病性，优化培养条件；分离纯化类胡萝卜素裂解酶；利用五种底物对所产类胡萝卜素裂解酶的酶学特性进行了深入、系统的研究；对类胡萝卜素裂解酶催化不同底物生成的产物进行鉴定，推断其作用位点。获得以下主要结论：
（1）巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性及培养条件的优化。对巴氏葡萄球菌 TS-82 进行毒力因子及药敏试验得到，该菌不具备致病性，可用于食品加工生产。对菌株 TS-82的培养条件进行优化，得到最适培养基为：蔗糖 41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3.7g/L，调 pH 至 7.0；培养条件为温度 36℃，接种量 2%，培养时间 16h，在此条件下可提高所产类胡萝卜素裂解酶的酶活。
（2）类胡萝卜素裂解酶的分离纯化。上述巴氏葡萄球菌 TS-82 所产类胡萝卜素裂解酶经 Mono Q 10/100 GL 强阴离子柱、高效制备液相和 Superdex Peptide 10/300 GL 多肽分子筛分离后，可得类胡萝卜素裂解酶纯酶；该酶降解 β-胡萝卜素的比活力为 125U/g，纯化倍数为 446，回收率为 2.39%。经高效液相色谱（HPLC）分析，确定该酶为单一峰，纯度达到 95%以上。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经 LC-ESI/MS 测定，得其分子量为655.093Da。

（3）酶学特性研究。关于底物特异性，以柱层析纯化后的酶为研究对象，研究结果表明所得纯酶可催化降解 β-阿朴-8'-胡萝卜醛、β-胡萝卜素、玉米黄质、角黄质和虾青素，未检测到其体外催化番茄红素的活性。根据 Lineweaver-Burk 法作图求得的 Km值和最大反应速率 Vmax可知，该酶与五种底物亲和力大小排列为：玉米黄质>虾青素>β-胡萝卜素>角黄质>β-阿朴-8'-胡萝卜醛，底物转化率为：玉米黄质>角黄质>虾青素>β-胡萝卜素>β-阿朴-8'-胡萝卜醛。关于酶学特性，该酶对 C40类胡萝卜素底物的最适温度为 60℃，而作用于 β-阿朴-8'-胡萝卜醛的最适温度是 50℃，该酶的稳定温度为 50℃以下；该酶对文中考察底物的最适 pH 为 3.0；Al3+和 Fe3+是该酶的强效催化剂，Fe2+是该酶的强效抑制剂，在 1mM 的情况下就可使该酶几乎完全失活；H2O2在低浓度范围内（0~16mM）可促进酶活；低浓度乙醇（0~16%）的添加对酶活影响不大，无抑制作用。

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参考文献（略）

本文编号：44071